劉海坡，闞濤，劉彩霞*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214000)2 (中國酒業(yè)協(xié)會，北京，100831) 3(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，浙江 紹興，312000)

食醋是具有悠久釀造歷史的酸性調(diào)味品和保存劑，在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮非常重要的作用[1]。食醋釀造包括酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵2個階段，具體釀造流程為：糯米→粉碎→蒸煮→糖化→酒精發(fā)酵→酒醅→拌麩皮、大糠→醋酸發(fā)酵→封醅→淋醋→煎醋→貯存→成品。酒精發(fā)酵階段將淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇，發(fā)酵成為用于制作食醋的低度酒(制醋酒)，隨后制醋酒進入醋酸發(fā)酵階段，將乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸最終成為食醋。

食醋酒精發(fā)酵階段包括淀粉質(zhì)原料的糊化、糖化和酒化，與我國黃酒生產(chǎn)方式相似[2]，主要是通過糖化酶、淀粉酶以及酒化酶系共同催化完成。在醋酸發(fā)酵階段主要是通過醋酸菌、乳酸菌等微生物將乙醇氧化為醋酸，這些微生物除了產(chǎn)生乙酸還能產(chǎn)生大量的風味物質(zhì)，賦予食醋豐富的口感和協(xié)調(diào)的香氣[3-4]。食醋酒精發(fā)酵作為食醋釀造的第一階段，對食醋質(zhì)量具有重要影響，不僅為醋酸發(fā)酵提供前體乙醇，同時制醋酒中的氨基酸、有機酸及多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)也是食醋風味的來源。

目前，已有諸多學(xué)者對食醋醋酸發(fā)酵階段的風味及微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化進行研究[5-10]，然而對食醋酒精發(fā)酵階段的研究卻鮮有報道。本研究首次通過HPLC及三代測序技術(shù)對食醋酒精發(fā)酵階段的非揮發(fā)風味物質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進行詳細分析，揭示食醋酒精發(fā)酵階段釀造機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋發(fā)酵醪樣品和酒曲取自江蘇制醋工廠車間。分別取0、48、96、144 h的發(fā)酵醪樣品，設(shè)置3個平行，樣品于-80 ℃保存。

三氯乙酸、異丙醇、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)等試劑均為分析純，標準樣品均為色譜純。PrimeSTAR?Max DNA Polymerase、DNA marker，寶生物工程(大連)有限公司；4S Green Plus 無毒核酸染料染色，上海生工；FastDigest Green Buffer 2×，Thermo Fisher公司；PCR產(chǎn)物純化試劑，杭州寶塞生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

PacBio RS II三代測序儀，美國太平洋生物科學(xué)公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Thermo Fisher Trace氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；5804R臺式高速大容量離心機，德國Eppendorf公司；164-5050電泳儀，北京六一儀器廠；Uniersal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-RAD公司。

1.3 實驗方法

樣品預(yù)處理：將取得的發(fā)酵醪液于10 000 r/min條件下離心10 min，取離心后上清液進行指標測定。

1.3.1 基本理化指標的測定

總酸、pH和酒精度檢測方法參照GB/T 13662—2018《黃酒》，還原糖濃度的測定采用DNS法[11]。

1.3.2 有機酸及氨基酸的測定

8種有機酸參照余寧華等[12]的方法進行測定，處理方法：0.75 mL上清液加入等體積三氯乙酸溶液(10%)，搖勻后于4 ℃靜置5 h，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜，用于HPLC分析。17種游離氨基酸參照QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》進行測定。

1.3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)的測定

提取不同批次、不同時間點發(fā)酵醪和酒曲的基因組，并擴增分析，樣品信息如表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

提取發(fā)酵醪液與酒曲的基因組，提取方法參考文獻[13]。

擴增分析：基因組擴增參照文獻[14]，選擇細菌16S rDNA、真菌28S rDNA通用引物進行擴增。PCR產(chǎn)物純化后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)測序。測序結(jié)果利用QIIME軟件[15]進行OTU分布統(tǒng)計、微生物群落、多樣性分析等統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋酒精發(fā)酵階段基本理化指標測定

食醋酒精發(fā)酵階段采用先糖化后發(fā)酵工藝，先將液化酶、糖化酶作用于米粉，后接種酵母、酒曲進行發(fā)酵，形成用于制造食醋的低度酒(制醋酒)。本研究分析制醋酒理化指標變化，如圖1所示，發(fā)酵0 h時還原糖質(zhì)量濃度為50.34 g/L，隨著發(fā)酵的進行，因微生物生長及產(chǎn)酒消耗還原糖呈現(xiàn)先急后緩的下降趨勢，在144 h降到2.50 g/L?？偹岷途凭瘸尸F(xiàn)上升趨勢，在144 h時總酸(以乙酸計)和酒精度分別達到4.71 g/L和8.43%ol，pH值在發(fā)酵過程中并未有明顯的變化。

圖1 食醋酒精發(fā)酵過程中理化指標的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes during inegar alcohol fermentation process

2.2 食醋酒精發(fā)酵階段有機酸與氨基酸的動態(tài)變化

在發(fā)酵過程中，制醋酒的有機酸質(zhì)量濃度呈上升趨勢(圖2)，144 h時達到(20.96±0.31)g/L。經(jīng)檢測得知，制醋酒中主要有機酸為乳酸和乙酸，與發(fā)酵黃酒一致[16]，其在發(fā)酵過程中呈增長趨勢，發(fā)酵144 h時分別達到(13.17±0.69)和(6.79±0.67)g/L，而其他有機酸質(zhì)量濃度遠低于傳統(tǒng)發(fā)酵黃酒，這對制醋酒風味的豐富度具有一定影響。

圖2 食醋酒精發(fā)酵過程中有機酸質(zhì)量濃度變化Fig.2 Changes of organic acid concentration during inegar alcohol fermentation process

制醋酒發(fā)酵過程中氨基酸質(zhì)量濃度變化如圖3所示，共檢測了17種氨基酸，其中包括6種甜味氨基酸，8種苦味氨基酸，2種鮮味氨基酸以及1種澀味氨基酸，其中制醋酒中甜味跟苦味氨基酸濃度最高，分別占據(jù)氨基酸總量18.36%和68.89%，然而雖釀制工藝與黃酒相似，但制醋酒與發(fā)酵黃酒中甜味與苦味氨基酸占比(31.22%、48.06%)差異較大。同時氨基酸總量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)上升趨勢，到144 h時達到692.61 mg/L，但制醋酒中總氨基酸濃度遠低于發(fā)酵黃酒[17]。有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸主要來源于原料中蛋白質(zhì)分解和微生物的代謝[18]，食醋酒精發(fā)酵階段氨基酸分布占比和濃度受微生物代謝的影響，因此需進一步分析食醋酒精發(fā)酵階段微生群落結(jié)構(gòu)。

圖3 食醋酒精發(fā)酵過程中氨基酸質(zhì)量濃度變化Fig.3 Changes of amino acid concentration during inegar alcohol fermentation process

2.3 制醋酒發(fā)酵液及酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 發(fā)酵醪與酒曲中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

對采集自工廠的發(fā)酵醪液和酒曲樣品進行測序，經(jīng)測序，樣品的Shannon指數(shù)隨著測序深度的增加趨于平坦，說明盡管隨著測序量的增加新的種系型可能會被發(fā)現(xiàn)，但是微生物的多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化，樣品測序數(shù)量達到了分析的要求，可進行后續(xù)分析。分析發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

圖4 發(fā)酵醪液及酒曲中真菌群落結(jié)構(gòu)組成(豐度1%以上)Fig.4 Bacteria community structure of fermentation mash and Jiuqu (abundance aboe 1%)

發(fā)酵144 h時，發(fā)酵醪中主要由戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus，28.60%)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，19.99%)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii，13.93%)以及解淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylolyticus，22.56%)組成，對比酒曲中細菌群落結(jié)構(gòu)，其主要由地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis，84.16%)組成，與發(fā)酵醪液差異較大。在發(fā)酵過程中，戊糖乳桿菌(L.pentosus)和檸檬酸明串珠菌(Leuconostoccitreum)在發(fā)酵過程中呈下降趨勢，解淀粉乳酸桿菌(L.pentosus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)呈上升趨勢，副干酪乳桿菌(L.paracasei)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。發(fā)酵過程中，雖微生物分布占比略有差異，但發(fā)酵醪液中微生物均以戊糖乳桿菌(L.pentosus)、副干酪乳桿菌(L.paracasei)、檸檬酸明串珠菌(L.citrinum)、解淀粉乳酸桿菌(L.pentosus)和德氏乳桿菌(L.delbrueckii)為主導(dǎo)。

在發(fā)酵過程中形成了以乳酸菌為主導(dǎo)、群落結(jié)構(gòu)簡單的微生物群系，這可能是造成制醋酒中乳酸濃度較高及風味單薄的原因之一。雖有文獻報道，明串珠菌具有一定的益生效果，能夠代謝產(chǎn)生雙乙酰、乙酸、乙醇等風味物質(zhì)[19-20]，但食醋酒精發(fā)酵過程中明串珠菌相對豐度較低，對于風味的影響較小。同時酒曲中地衣芽孢桿菌(B.licheniformis，84.16%)相對豐度最高，有高分泌堿性蛋白酶的能力，是工業(yè)酶生產(chǎn)中最重要的細菌之一[21]，然而其卻未能成為黃酒發(fā)酵醪中的優(yōu)勢物種，可能是由于地衣芽孢桿菌適宜于堿性環(huán)境下生長(pH 6.8～8.0)[22]，而食醋酒精發(fā)酵階段添加酒曲量較低且黃酒發(fā)酵醪的pH較低(3.17～3.27)，使得酒曲中的地衣芽孢桿菌未能在發(fā)酵醪中成為優(yōu)勢菌種。雖芽孢桿菌未能在發(fā)酵醪液中成為優(yōu)勢菌，但其可分泌蛋白酶、淀粉酶等，發(fā)揮液化和糖化作用，并且可通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生有機酸，有助于提升酒曲乃至食醋的品質(zhì)[23-24]。

2.3.2 發(fā)酵醪及酒曲中真菌群落結(jié)構(gòu)分析

發(fā)酵醪及酒曲中真菌群落結(jié)構(gòu)如圖5所示，在種水平上，釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)在發(fā)酵醪和酒曲中均占據(jù)絕對優(yōu)勢。酒曲中釀酒酵母占比較高，相對豐度達到96.64%，可能與工廠制曲環(huán)境以及接觸器具有關(guān)。除釀酒酵母以外，酒曲中具有糖化、液化能力的曲霉、根霉屬占比較少，導(dǎo)致酒曲在發(fā)酵中起的糖化、液化作用十分有限，這也是工廠在食醋酒精發(fā)酵階段主要利用液化酶和糖化酶進行淀粉酶解的原因之一。同時在發(fā)酵醪中，釀酒酵母相對豐

圖5 發(fā)酵醪液及酒曲中真菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig.5 Fungal community structure of fermentation mash and Jiuqu

度也最高，達到99%以上，發(fā)酵醪中釀酒酵母占絕對優(yōu)勢可能與食醋酒精發(fā)酵中利用酒曲以及純種黃酒活性干酵母接種有關(guān)。

根據(jù)微生物檢測結(jié)果可知，食醋酒精發(fā)酵過程中形成了以乳桿菌、明串珠菌和釀酒酵母為主導(dǎo)的微生物群系，這可影響發(fā)酵過程有機酸以及氨基酸的濃度與組成。有研究分析細菌、真菌與有機酸之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬、明串珠菌屬是乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等主要有機酸的主要貢獻者，且在真菌與有機酸模型的分析中發(fā)現(xiàn)，酵母菌屬與有機酸的形成存在一定的相關(guān)性[25]。同時有研究對3株釀酒酵母發(fā)酵過程中游離氨基酸變化進行分析，發(fā)現(xiàn)3株釀酒酵母發(fā)酵液中均含有17種游離氨基酸，但游離氨基酸組成和濃度存在明顯差異[26]，即釀酒酵母可產(chǎn)生氨基酸但不同的釀酒酵母產(chǎn)生的氨基酸的濃度與種類不同，這可能也是造成制醋酒中氨基酸濃度、組成與傳統(tǒng)黃酒差異較大的原因之一。同時也有研究通過宏基因組功能注釋發(fā)現(xiàn)，酵母屬涉及了葡萄糖降解、乳酸生成與代謝、乙酸生成、乙醇生成等的完整酶系、氨基酸、γ-氨基丁酸生成和降解、醇類、脂肪酸、酯類、酚類物質(zhì)等物質(zhì)代謝均于酵母屬相關(guān)[27]，即釀酒酵母在酒精發(fā)酵階段對于葡萄糖、酒精、氨基酸、有機酸的代謝具有重大作用。由此可知，食醋酒精發(fā)酵中以乳桿菌、明串珠菌和釀酒酵母為主導(dǎo)的微生物群系對發(fā)酵過程理化指標以及非揮發(fā)性風味物質(zhì)有機酸、氨基酸的濃度以及組成具有十分重要的作用。

3 結(jié)論

本研究對酒精發(fā)酵階段制醋酒的理化指標及非揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，以研究酒精發(fā)酵階段釀造機理進一步指導(dǎo)生產(chǎn)。酒精發(fā)酵結(jié)束時(144 h)酒精度在7%～9%ol，總氨基酸質(zhì)量濃度為692.61 mg/L，較傳統(tǒng)發(fā)酵黃酒低[16]，可能是由于酒精發(fā)酵階段采用的是黃酒的簡化工藝，米水比低、發(fā)酵時間短、酵母接種量低，導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異進而造成指標較低。

通過分析食醋酒精發(fā)酵醪液中微生物發(fā)現(xiàn)，其構(gòu)成主要為解淀粉芽孢桿菌(L.amylolyticus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、副干酪乳桿菌(L.paracasei)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)、檸檬酸明串珠菌(L.citreum)及釀酒酵母(S.cereisiae)，相對豐度>1%的僅有6種，微生物群落結(jié)構(gòu)簡單，且均有產(chǎn)酸特性，可大量產(chǎn)酸。同時酒曲中的細菌和真菌分別以地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和釀酒酵母(S.cereisiae)為主，酒曲中具有糖化、液化作用的霉菌占比極低(1%以下)，其發(fā)揮的糖化、液化能力有限，這也是食醋酒精發(fā)酵過程中利用糖化、液化酶進行水解的原因之一。

本研究明確了食醋酒精發(fā)酵階段以乳酸菌、釀酒酵母為主導(dǎo)，他們對于有機酸、氨基酸的質(zhì)量濃度和組成具有較大的影響。在本研究基礎(chǔ)上，可在食醋酒精發(fā)酵階段選用性能優(yōu)良的酵母，以調(diào)整有機酸、氨基酸質(zhì)量濃度達到產(chǎn)品香氣、口感的協(xié)調(diào)。同時研究發(fā)現(xiàn)，酒曲微生物結(jié)構(gòu)簡單、糖化和液化能力相對較弱，由此，可從食醋制曲階段入手改良制曲工藝，豐富酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，增加酒曲液化、糖化力，使其逐漸取代酶制劑在食醋釀造中的使用。本研究分析食醋酒精發(fā)酵階段非揮發(fā)性風味物質(zhì)變化，并利用三代測序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成并探討其對于理化指標與非揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響，解析了食醋酒精發(fā)酵階段釀造機理，可為改進食醋發(fā)酵工藝和調(diào)控食醋產(chǎn)品品質(zhì)提供支持。