曹艷花，馮會(huì)粉，程坤，劉波，都海渤，謝九艷，辛迪，姚粟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

生胞梭菌(Clostridiumsporogenes)源于1908年METCHNIKOFF提出的Bacillussporogenes[1]，由BERGEY等[2]于1923年正式命名為Clostridiumsporogenes，收錄于1980年細(xì)菌名稱的批準(zhǔn)名錄(approed lists 1980)中[3]。生胞梭菌(C.sporogenes)種名sporogenes(sporos-genes)即spore-producing，譯為產(chǎn)芽胞，故又名產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)胞梭菌。

生胞梭菌在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛。生胞梭菌可在食品行業(yè)檢測(cè)中作為對(duì)照菌株。生胞梭菌是生物危害程度4類的菌種，在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病，其從表型和基因型方面都與肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)親緣關(guān)系最近，可用做肉毒梭菌(C.botulinum)檢測(cè)試驗(yàn)中培養(yǎng)基驗(yàn)證、方法學(xué)驗(yàn)證和樣品增菌階段的陽性對(duì)照菌株[4]。生胞梭菌在醫(yī)藥等行業(yè)可作為藥品控制菌在微生物污染定性檢測(cè)中起重要作用[5]。我國(guó)藥典控制菌檢查類群包括生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)等[6]，用于無菌檢查法通過微生物培養(yǎng)檢查藥品是否無菌，其他如歐洲藥典、美國(guó)藥典、日本藥局方也有用到生胞梭菌[7]。我國(guó)2020版藥典《1101 無菌檢查法》和《1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法》中繼續(xù)使用生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)[8]。生胞梭菌亦可用作生物指示劑，如驗(yàn)證一個(gè)滅菌工藝系統(tǒng)能否使產(chǎn)品滅菌后達(dá)到無菌要求，可采用生胞梭菌進(jìn)行相應(yīng)的物理性驗(yàn)證及生物指示劑驗(yàn)證[9-10]。我國(guó)2020版藥典《1421 滅菌法》微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)中根據(jù)滅菌工藝選擇適宜的生物指示劑，對(duì)于熱不穩(wěn)定性物品滅菌常用的生物指示劑為生胞梭菌。生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)應(yīng)用廣泛，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)及鑒定具有重要意義。

本研究針對(duì)梭菌屬中的生胞梭菌，以中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)保藏菌株CICC 10385(=CMCC 64941)為研究對(duì)象，進(jìn)行基于WGS的平均核苷酸一致性(aerage nucleotide identity，ANI)種水平鑒定，為明確菌種分類學(xué)地位、確保使用安全等方面提供依據(jù)，同時(shí)為研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為梭菌屬(Clostridiumsp.)相關(guān)菌種的鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株CICC 10385為CICC保藏菌株，CICC 10385菌株等同編號(hào)為CMCC 64941。

1.1.2 試劑

卵黃瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司；2×PCR Mix、DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；API 20 A檢驗(yàn)試劑條、ITEK ANC鑒定卡，法國(guó)梅里埃公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；5415D離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；professional TRIO 48型PCR儀，德國(guó)Biometra公司；BioDrop μLite微量核酸蛋白分析儀，英國(guó)Biochrom公司；Gel Doc EZ凝膠成像分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司；BGISEQ-500全基因組測(cè)序儀，深圳華大智造科技有限公司(MGI Tech Co.Ltd.)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株轉(zhuǎn)接、活化與保藏

采用平板涂布法對(duì)凍干管菌種CICC 10385進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化。在生物安全柜中使用無菌槍頭吸取無菌水置于凍干管中混勻，涂布卵黃瓊脂培養(yǎng)基平板，置于加裝厭氧袋的厭氧罐后密封，35 ℃培養(yǎng)48 h。待單菌落出現(xiàn)后，劃線法轉(zhuǎn)接至卵黃瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，置于4 ℃冰箱保藏。同時(shí)將活化的菌株以甘油管形式保藏于CICC備用。

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

將CICC 10385接種于卵黃瓊脂培養(yǎng)基平板，置于加裝厭氧袋的厭氧罐后密封，35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上的宏觀形態(tài)特征，并利用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌體微觀形態(tài)特征[11]。

1.3.3 生理生化特征檢測(cè)

采用API 20A檢測(cè)試劑條及ITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)中的ITEK ANC鑒定卡，依據(jù)其說明書中操作步驟對(duì)CICC 10385的酶活性、碳源利用等生理生化特征進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 WGS和ANI分析

1.3.4.1 WGS和組裝

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取CICC 10385基因組DNA，并采用微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量和濃度，確保符合文庫(kù)構(gòu)建要求。檢測(cè)合格的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建與上機(jī)測(cè)序。獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，過濾掉外源序列以及質(zhì)量較低的序列信息，獲得較高質(zhì)量的序列信息，將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)使用SPAdes 3.11.0軟件進(jìn)行拼接組裝獲得基因組序列及基因組序列總長(zhǎng)度、contigs數(shù)量、(G+C) mol%含量等參數(shù)值。

1.3.4.2 16S rRNA基因預(yù)測(cè)及序列系統(tǒng)發(fā)育分析

使用RNAmmer 1.2軟件進(jìn)行全基因組中16S rRNA基因預(yù)測(cè)，獲得序列通過模式菌株序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，獲得同近緣種序列相似性[12-14]。采用MEGA 5.0軟件中的p-distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹[15]，自展值(bootstrap alues)設(shè)為1 000分析評(píng)估進(jìn)化樹的穩(wěn)定性，進(jìn)行菌株CICC 10385的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4.3 ANI分析

進(jìn)行CICC 10385全基因組ANI分析[16]，將16S rRNA基因序列相似性>98.65%的模式菌株作為ANI分析比對(duì)參考模式菌株，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載參考模式菌株全基因組序列。利用ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進(jìn)行CICC 10385全基因組序列和參考模式菌株序列比對(duì)，若實(shí)驗(yàn)菌株僅與1個(gè)參考模式菌株序列ANI值大于95%～96%[17-18]，則判定實(shí)驗(yàn)菌株與此參考模式菌株為同1個(gè)種。通過核心基因系統(tǒng)發(fā)育分析(core-genome multi-locus sequence typing，cgMLST)，獲得CICC 10385與近緣模式菌株全基因組序列的共有基因，采用TreeBeST 1.9.2中PHYML基于最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設(shè)為100。采用Genome-to-Genome Distance Calculator(GGDC 3.0，http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php)計(jì)算CICC 10385與近緣模式菌株的DNA-DNA雜交(DNA-DNA hybridization，DDH)值，70%可作為原核生物種水平判定閾值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CICC 10385的轉(zhuǎn)接活化與形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)過凍干管打管轉(zhuǎn)接活化實(shí)驗(yàn)菌株CICC 10385，在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落直徑為3～6 mm，菌落白色、近圓形、扁平、邊緣不規(guī)則，菌落珍珠層樣，周圍窄虹彩樣薄層(圖1-a)；光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體直桿狀或稍彎曲，(0.5～0.6) μm×(1.1～4.1) μm，單個(gè)或成對(duì)排列，芽胞橢圓形，近端生，胞囊膨大，革蘭氏陽性(圖1-b)。電子顯微鏡菌體形態(tài)見圖1-c。結(jié)果顯示CICC 10385的形態(tài)特征符合伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)中對(duì)生胞梭菌的基本特征描述[11]。

a-宏觀形態(tài)學(xué)觀察；b-光學(xué)顯微鏡觀察；c-掃描電鏡觀察圖1 CICC 10385的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Morphological obseration result of CICC 10385

2.2 菌株CICC 10385生理生化特征

經(jīng)API 20A檢測(cè)試劑條和ITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)中的ITEK ANC鑒定卡對(duì)菌株CICC 10385的酶活性、利用碳源產(chǎn)酸等生理生化特征進(jìn)行檢測(cè)。API 20A檢測(cè)試劑條鑒定系列有21個(gè)測(cè)定指標(biāo)，能快速、簡(jiǎn)便地對(duì)厭氧菌進(jìn)行生化鑒定。API 20A檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株CICC 10385能水解明膠與七葉靈，能利用麥芽糖和海藻糖產(chǎn)酸，不能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、柳醇、木糖、阿拉伯糖、甘油、纖維二糖、甘露糖、松叁糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖、海藻糖等產(chǎn)酸。采用API 20A鑒定檢測(cè)與生胞梭菌和肉毒梭菌相似率均為99.9%。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)顯示具有牛奶不凝固、蛋白胨-酵母膏-葡萄糖+膽堿培養(yǎng)基不生長(zhǎng)、淀粉不水解等特征。API 20A檢測(cè)結(jié)果詳見表1。

表1 CICC 10385的API 20A檢測(cè)結(jié)果Table 1 API 20A test result of CICC 10385

ITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)中的ITEK ANC厭氧菌鑒定卡基于已建立的生化方法并采用新開發(fā)的底物，共有36種檢測(cè)碳源利用和酶活性的生化試驗(yàn)，能快速、簡(jiǎn)便地對(duì)厭氧菌進(jìn)行生化鑒定[20]。ITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，CICC 10385能產(chǎn)L-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶，能利用麥芽三糖，不能利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-麥芽糖等，與生胞梭菌鑒定概率百分比[21]為99%，ITEK 2 Compact檢測(cè)結(jié)果詳見表2。

表2 CICC 10385的ITEK 2 Compact檢測(cè)結(jié)果Table 2 ITEK 2 Compact test result of CICC 10385

2.3 WGS和ANI分析

2.3.1 WGS和組裝

采用全基因測(cè)序儀對(duì)CICC 10385進(jìn)行全基因組從頭測(cè)序，測(cè)得全基因組大小為4 252 276 bp，含有58個(gè)contigs，基因組(G+C)mol%為27.9%。NCBI登錄號(hào)為GCA_013867655.1，序列片段歸檔數(shù)據(jù)庫(kù)(sequence read archie，SRA)中登錄號(hào)為SRR9967484。

2.3.2 16S rRNA基因預(yù)測(cè)及序列系統(tǒng)發(fā)育分析

通過RNAmmer 1.2預(yù)測(cè)CICC 10385全基因組中16S rRNA基因序列為1 500 bp，將該序列通過模式菌株序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，同生胞梭菌(C.sporogenes)、肉毒梭菌(C.botulinum)、孔氏梭菌(C.combesii)、C.tepidum模式菌株序列相似性分別為99.86%、99.72%、99.72%、99.02%，同其余參考模式菌株序列相似性均低于98.65%。以O(shè)xobacterpfennigiiDSM 3222T(X77838)序列為外群，鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建CICC 10385與其近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示通過16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析可以將菌株CICC 10385鑒定為梭菌屬(Clostridiumsp.)。

圖2 鄰接法構(gòu)建CICC 10385和近緣種16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of CICC 10385 and related species

2.3.3 ANI分析

采用ANI Calculator(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進(jìn)行CICC 10385和梭菌屬(Clostridiumsp.)內(nèi)近緣模式菌株的全基因組序列比對(duì)分析[22]。結(jié)果顯示CICC 10385同生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)模式菌株序列ANI值為99.39%，高于ANI用于細(xì)菌種水平鑒定的判定閾值95%～96%[17-18]，同肉毒梭菌(C.botulinum)ATCC 25763T(GCA_001276985.1)、孔氏梭菌(C.combesii)DSM 20696T(GCA_002749945.1)、C.tepidumIEH 97212T(GCA_002008345.1)模式菌株ANI值分別為91.88%、91.87%、88.16%，與梭菌屬其余模式菌株ANI值均低于95%，判定CICC 10385與生胞梭菌為同1個(gè)種。通過cgMLST分析，獲得CICC 10385與近緣模式菌株885個(gè)核心基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，在cgMLST系統(tǒng)發(fā)育樹中，CICC 10385與生胞梭菌以100%支持率聚在同一分支，且與梭菌屬內(nèi)其他菌種明顯區(qū)分開。采用GGDC 3.0計(jì)算獲得CICC 10385同生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)模式菌株序列DDH值為94.8%，同其余參考模式菌株DDH值均低于70%，符合種水平判定標(biāo)準(zhǔn)。綜上，基于WGS的ANI分析，菌株CICC 10385被鑒定為生胞梭菌。

圖3 最大似然法構(gòu)建CICC 10385和近緣種核心 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Maximum likelihood phylogenetic tree based on core-genome sequences of CICC 10385 and related species

3 結(jié)論與討論

本研究采用基于WGS的ANI分析對(duì)菌株CICC 10385進(jìn)行種水平鑒定并首次獲得生胞梭菌CICC 10385(=CMCC 64941)的全基因組序列。采用微生物學(xué)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對(duì)35 ℃條件下的CICC 10385進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化，并通過形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析獲得其基礎(chǔ)信息。采用BGISEQ-500全基因測(cè)序儀進(jìn)行WGS，SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接獲得全基因組序列。采用RNAmmer軟件進(jìn)行16S rRNA基因預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲得與CICC 10385親緣關(guān)系較近菌種信息。采用ANI Calculator軟件對(duì)CICC 10385和近緣菌種進(jìn)行全基因組ANI等分析。獲得CICC 10385的全基因組大小為4 252 276 bp，含有58個(gè)contigs，基因組(G+C)mol%為27.9%。16S rRNA基因序列分析與生胞梭菌(C.sporogenes)、肉毒梭菌(C.botulinum)、孔氏梭菌(C.combesii)和C.tepidum最為近緣，ANI分析與生胞梭菌DSM 795T(GCA_001020205.1)的ANI值為99.39%，與梭菌屬其余菌種ANI值均低于95%，通過cgMLST系統(tǒng)發(fā)育分析與生胞梭菌以100%支持率聚在同一分支，且與其他菌種明顯區(qū)分開，同生胞梭菌DDH值為94.8%，同其余參考模式菌株DDH值均低于70%，符合種水平判定標(biāo)準(zhǔn)，可明確將CICC 10385鑒定為生胞梭菌。經(jīng)研究表明基于WGS的ANI分析是準(zhǔn)確有效的生胞梭菌種水平鑒定方法。

菌種鑒定通常基于表型和基因型的多相分類鑒定技術(shù)方法[23]，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，分子DNA鑒定技術(shù)廣泛應(yīng)用，WGS也變得越來越普遍。自2018年1月起，InternationalJournalofSystematicandEolutionaryMicrobiology要求發(fā)表微生物新種需提供基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，并在分類中增加這部分的描述?；赪GS的ANI值95%～96%與DDH值70%、16S rRNA基因序列相似性98.65%相對(duì)應(yīng)，可作為原核生物種水平的判定閾值[17-18]。全基因組序列數(shù)據(jù)不僅能夠提供菌株的分類鑒定信息，還能提供菌株毒力因子、臨床抗微生物藥物產(chǎn)生或耐受以及已知有毒代謝物產(chǎn)生等其他安全特性信息。隨著微生物在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，菌株安全性評(píng)價(jià)的重要性會(huì)愈加凸顯，基于WGS的鑒定方法將提供重要數(shù)據(jù)信息，其應(yīng)用會(huì)愈加廣泛。

生胞梭菌(C.sporogenes)在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛，采用基于WGS的ANI分析對(duì)其進(jìn)行種水平鑒定研究，明確其菌種分類學(xué)地位具有重要意義。本研究對(duì)CICC 10385的分類地位進(jìn)行基于全基因組測(cè)序平均核苷酸一致性的準(zhǔn)確鑒定，為針對(duì)該菌及梭菌屬(Clostridiumsp.)等相關(guān)菌種鑒定研究提供理論依據(jù)，為開展其生物學(xué)功能的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。