陳寧，常保根，施念，路福平，劉夫鋒

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室， 天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

異麥芽酮糖(isomaltulose)，又稱帕拉金糖，是一種功能性二糖。異麥芽酮糖作為蔗糖的同分異構體，與蔗糖有著相似的口感和物理性質。與蔗糖相比，異麥芽酮糖具有良好的酸穩(wěn)定性、極低的吸濕性和較高的安全性，在食品中具有廣闊的市場應用前景[1-3]。作為新型的甜味劑，異麥芽酮糖還具有甜度低(約為蔗糖甜度的50%)、易于吸收、非致齲齒性和低熱量等優(yōu)點，非常適合肥胖患者、糖尿病人和體育運動員等食用[4-5]。此外，本身為還原糖的異麥芽酮糖還可作為前體生產新型功能性食用糖醇[6]。鑒于其優(yōu)良的特性，異麥芽酮糖也受到越來越多人的關注。

目前，異麥芽酮糖主要是利用蔗糖異構酶(sucrose isomerase, SIase, EC 5.4.99.11)異構催化蔗糖生成，催化作用如圖1所示。然而，游離SIase在工業(yè)生產中存在產物的純化分離難度大，不可回收再利用等缺點，酶固定化成為解決上述問題的手段之一。近年來，關于SIase固定化的研究已有少量報道。CONTESINI等[7]利用微膠囊包埋法和硅藻土吸附法將來源于Erwiniasp.的SIase進行固定化，所得2種固定化酶的酶活力回收率和操作穩(wěn)定性均較差；為了提高固定化后的酶活力，WU等[8-9]采用ε-poly-L-lysine修飾的介孔TiO2和海綿作為載體固定化SIase，所得固定化酶的酶活力回收率分別為84.5%和93.2%；在此基礎上，孟虹等[10]又制備了SIase-Cu2+納米花固定化酶，在4 ℃保存15 d后仍能保留80%的初始活性，且循環(huán)使用6次后，仍剩余40%酶活性。表明固定化明顯提高了SIase的操作穩(wěn)定性和酶活力回收率，且固定化材料較為新穎，但由于生產成本較高，限制了工業(yè)化的大規(guī)模生產。因此，尋求成本經濟、操作簡單、酶活力回收率高且操作穩(wěn)定性良好的SIase固定化方法受到越來越多的關注。

吸附固定化與交聯固定化是酶固定化的常用方法。然而，單純物理吸附所得固定化酶穩(wěn)定性較差，酶易泄露，且隨機的物理吸附無法控制載體表面酶的密度，易形成多層吸附繼而對酶的催化活性造成不利影響[11]；而直接通過交聯得到的酶聚集體，大小無法控制，對于較大的交聯聚集體，大量的酶被包裹在聚集體內部，不易與底物接觸，造成酶催化活性降低，且聚集體的機械性能較差，實際應用受到限制[12]。因此在實際生產中常常將這2種方法結合使用，吸附-交聯固定化可將酶的回收與固定化同時進行，適用于發(fā)酵液中酶的固定化，不僅提高了酶的構象穩(wěn)定性和固定化酶的機械性能，還具有成本低廉、制備過程簡單、酶結合牢固、適用于非特異性載體等優(yōu)點。硅納米粒子(silica nanoparticle, SNP)具有機械強度高、化學/熱穩(wěn)定性好、成本低、易獲得、不與酶反應、比表面積大等特性，在酶的固定化領域應用廣泛[13-14]。

圖1 蔗糖異構酶的水解作用和異構化作用的反應機理Fig.1 Reaction mechanism of SIase-catalyzed hydrolysis and isomerization

本研究擬利用吸附-交聯法對SIase進行固定化。首先采用硅納米粒子為載體對SIase進行吸附，后用戊二醛(glutaraldehyde,GA)對吸附在硅納米粒子周圍的酶進行交聯，優(yōu)化蔗糖異構酶吸附-交聯固定化條件，并對固定化酶的酶學性質(催化活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性和操作穩(wěn)定性)進行探討，以期得到高效的SIase固定化酶，為其工業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115，本實驗室保藏。

材料和試劑：硅納米粒子(500 nm，實心球體)，Aladdin；戊二醛(250 g/L)、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4，上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖，上海源葉生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、YNB培養(yǎng)基、甘油、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、生物素， 賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6D電泳儀，北京市六一儀器廠；HZS-H水浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯電子有限公司；Mettler-Toledo電子天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；Centrifuge 5418小型高速離心機、Heto Drywinner冷凍干燥機、MaxQ6000恒溫調速搖床、Multiskan Spectrum酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；WP25AB臺式電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蔗糖異構酶的制備

取適量保存于本實驗室-80 ℃冰箱的畢赤酵母，采用三區(qū)劃線法接種于YPD固體培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉)上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d，獲得單菌落。將單菌落接種至5 mL的YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中，30 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，轉移至250 mL的BMGY培養(yǎng)基[1%酵母粉、2%蛋白胨、2%甘油、0.2%生物素、25 mL 10×YNB、磷酸鹽緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)]中傳代培養(yǎng)16 h(30 ℃、220 r/min)；3 000 r/min條件下離心5 min收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基[1%酵母粉、2%蛋白胨、0.2%的生物素、25 mL 10×YNB、磷酸鹽緩沖液(1 mol/L，pH 6.0)]清洗菌體2遍以除去甘油等物質。最后將菌體重懸于250 mL BMMY培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，每天早晚各加入0.5%(體積分數)的甲醇，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 d后，將發(fā)酵液于3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，所得上清液即為SIase粗酶液，保存于4 ℃?zhèn)溆?。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測定SIase的純度。

1.3.2 酶活力測定

將400 μL含有蔗糖(250 g/L)的磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，pH 6.0)和100 μL適當稀釋的酶溶液在2 mL的EP管中充分混合，置于35 ℃水浴中反應10 min，后煮沸5 min以終止反應。利用3,5-二硝基水楊酸比色法(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)測定生成還原糖的量。1個酶活力單位是指1 min內催化蔗糖異構產生1 μmol異麥芽酮糖所需的酶量。固定化酶活力回收率按公式(1)計算：

(1)

1.3.3 蔗糖異構酶的固定化

稱取25 mg硅球，加入4 mL含一定酶活力的磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)，于4 ℃振蕩吸附一段時間，得到硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)；后加入適量戊二醛溶液進行交聯，在4 ℃條件下振蕩交聯一段時間，離心收集固定化酶，用磷酸鹽緩沖溶液反復洗滌以除去未交聯的游離酶和戊二醛，得到硅球吸附交聯固定化酶(S-CLEAs-GA)。

以固定化酶活力回收率為指標，分別研究酶添加量(5.2、6.9、8.6、10.4、12.1 U/mL)、吸附時間(2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、交聯時間(1、2、3、4、5 h)和戊二醛添加量(0.5、0.6、0.8、0.9、1.0 g/L)對固定化效果的影響。

1.3.4 固定化酶的穩(wěn)定性測定

1.3.4.1 溫度對酶活性的影響

為考察溫度對SIase固定化前后酶活性的影響，測定了各種酶制劑在不同溫度下處理后的剩余酶活力。用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)配制等濃度的游離和固定化酶溶液，并將各種酶制劑分別置于不同溫度(25～55 ℃)的恒溫水浴中處理30 min后，按照1.3.2中的酶活性測定方法，以蔗糖為底物在25 ℃條件下測定各酶制劑的剩余活性。

1.3.4.2 pH對酶活性的影響

為考察pH對SIase固定化前后酶活力的影響，測定了這種酶制劑在不同pH下處理后的剩余酶活力。具體如下：以不同pH的緩沖液[磷酸氫二鈉-檸檬酸鈉(pH 4.0、5.0),磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(pH 6.0、7.0)和Tris-HCl(pH 8.0、9.0)]為溶劑，分別配制相同濃度的游離和固定化酶溶液，并將其置于25 ℃水浴搖床中處理2 h；按照1.3.2中的酶活性測定方法，以蔗糖為底物在25 ℃條件下測定各種酶制劑的剩余活性。

1.3.4.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

取一定量的S-CLEAs和S-CLEAs-GA，配制成相同濃度的固定化酶溶液，在最適反應條件下以蔗糖為底物測定其活性。將反應溶液離心分離去上清液，用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L, pH 6.0)反復洗滌，以除去未反應的底物和產物；隨后將離心洗滌后的固定化酶重新分散于緩沖液中，加入新的底物進行下一次的反應，如此重復15次。連續(xù)測定固定化酶在循環(huán)多次后的剩余酶活力，將第一次使用時的酶活力定義為100%。

2 結果與分析

2.1 SIase游離酶的制備

發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳分析如圖2所示，在分子質量約為65 kDa處觀察到明顯的目的條帶，說明發(fā)酵上清液中主要含有SIase。

M-蛋白質標準；1-SIase發(fā)酵上清液圖2 蔗糖異構酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of sucrose isomerase

2.2 固定化酶的制備與優(yōu)化

在硅球質量濃度為6.25 mg/mL、4 ℃條件下，吸附足夠長的時間，以考察不同酶加量對固定化酶活力回收率的影響，結果如圖3所示。當酶加量為8.6 U/mL時，酶活力回收率達到最大，為51.7%。但繼續(xù)提高酶加量，酶活力回收率卻明顯下降，這可能是由于大量酶沉淀在硅球表面導致聚集，即SIase在載體上形成多層吸附，導致了空間位阻效應，限制了底物的傳質，從而催化活性降低[11]。因此，選取初始酶加量為8.6 U/mL。

圖3 酶加量對固定化酶活力回收率的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、4 ℃的條件下，研究了吸附時間對固定化酶活力回收率的影響，結果見圖4。隨著吸附時間的延長，固定化酶的酶活力回收率先增加后降低，在吸附時間為5 h時，載體和酶的作用達到飽和，酶活力回收率達到最大值，為51.5%。當吸附時間大于5 h，酶活力回收率下降明顯，這可能是由于酶自身穩(wěn)定性的限制，酶失活的幾率隨吸附時間的延長而增加。因此確定吸附時間為5 h，且此時所得的硅球吸附固定化酶命名為S-CLEAs。

圖4 吸附時間對固定化酶活力回收率的影響Fig.4 Effect of adsorption time on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、吸附時間為5 h、4 ℃的條件下，研究了戊二醛添加量對固定化酶活力回收率的影響(圖5)。戊二醛是酶固定化制備過程中最常用的交聯劑。從圖5可以看出，固定化酶活力回收率隨著戊二醛添加量的增加先增大后減小，主要是因為戊二醛既可作為交聯劑又是酶的變性劑[15]。當加入少量戊二醛時，酶因為在硅球表面不充分的交聯而導致酶活力回收率較低，且在使用過程中酶易脫落，損失較多；繼續(xù)提高戊二醛添加量后，酶活力回收率下降，這是由于過量的戊二醛造成了酶分子之間的過度交聯，且將過多的酶交聯在一起，影響了酶蛋白的活性[12]；當戊二醛添加量為0.08%時，S-CLEAs-GA的酶活力回收率最高，達到44.9%。因此，S-CLEAs-GA的最適戊二醛添加量為0.08%。

圖5 戊二醛添加量對固定化酶活力回收率的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on actiity recoery of immobilized enzyme

在硅球質量濃度為6.25 mg/mL、加酶量為8.6 U/mL、吸附時間為5 h、戊二醛添加量為0.08%、4 ℃的條件下，研究了交聯時間對固定化酶活力回收率的影響，結果如圖6所示。當交聯時間為2 h時，酶活力回收率達到最高值，為44.2%。繼續(xù)延長交聯時間，酶活力回收率下降趨勢明顯。這可能是由于過長時間的交聯，導致形成的固定化酶的網絡結構太過緊密，使S-CLEAs-GA空間位阻變大，阻礙了酶與底物的接觸，造成酶活力的下降[16]。因此，制備S-CLEAs-GA的最佳交聯時間是2 h。

圖6 交聯時間對固定化酶活力回收率的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on actiity recoery of immobilized enzyme

采用吸附法和吸附-交聯法對SIase進行固定化，并對其固定化條件進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)的固定化條件為：加酶量為8.6 U/mL，吸附時間為5 h，戊二醛添加量為0.08%，交聯時間為2 h。得到2種固定化酶，硅球吸附固定化酶(S-CLEAs)和硅球吸附-交聯固定化酶(S-CLEAs-GA)，酶活力回收率分別為51.2%和44.9%。

2.3 固定化酶的酶學特性

溫度對游離酶和固定化酶活性的影響見圖7。隨著溫度的上升，游離酶和固定化酶的活性也隨之降低，且當處理溫度較高時，酶制劑活性急劇下降，這可能是由于高溫引起的酶的變性所致[17]；但固定化酶在實驗測定所有溫度下均表現出較高的抗熱應力穩(wěn)定性。

圖7 溫度對游離SIase和固定化酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature on the actiities of free SIase and immobilized enzyme

為了進一步研究固定化酶在極端pH條件下的耐受性，將各種酶樣品置于不同pH緩沖溶液中處理并測定其剩余活性，結果如圖8所示?？梢钥闯?，游離SIase受環(huán)境酸堿度變化的影響更大，且在酸性環(huán)境中活性下降的更為明顯。在相同處理條件下，固定化酶的耐受性提高，尤其是在酸性環(huán)境中，說明SIase的固定化有利于穩(wěn)定酶的結構[18]。

圖8 pH對游離SIase和固定化酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on the actiities of free SIase and immobilized enzyme

穩(wěn)定性實驗結果表明，與游離酶相比，固定化酶表現出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。將SIase通過非共價鍵吸附固定在硅球表面(S-CLEAs)，由于不涉及共價鍵的形成，很大程度地保留了酶分子結構的完整性，減少了因構象變化造成的活性損失[19-20]。而S-CLEAs-GA主要是酶分子間通過交聯劑多點共價連接在硅球的周圍，這樣可增強酶的剛性、提高構象穩(wěn)定性、防止酶的構象轉變并保護酶結構不被破壞，增強了酶抵抗外界條件的能力[21-22]。但由于交聯對酶分子構象的影響較大，與S-CLEAs(51.2%)相比，S-CLEAs-GA的酶活力回收率比較低(44.9%)。

2.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶的重復使用穩(wěn)定性對其工業(yè)應用具有重要意義。以蔗糖為底物，分別考察了S-CLEAs和S-CLEAs-GA在連續(xù)使用15次后酶活力回收率的變化，結果見圖9。可以看出，隨著循環(huán)使用次數的增加，2種固定化酶的酶活力回收率都有所降低。循環(huán)使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA的酶活力回收率分別為55.1%和77.9%。表明S-CLEAs-GA的操作穩(wěn)定性明顯優(yōu)于S-CLEAs，主要是由于S-CLEAs在連續(xù)振蕩、回收、洗滌、重復使用等頻繁處理過程中，吸附在載體表面的酶脫落，引起整個反應體系中酶活力的降低[23]。而經戊二醛交聯所得的S-CLEAs-GA面對這些操作時，可以很好地將酶保留在載體的表面。此外，在重復使用過程中酶的變性也是固定化酶活力損失的一個重要原因[24]。THMTURK等[25]將聚乙烯亞胺包裹在SNP表面，并以此為載體通過靜電吸附固定化乙酰膽堿酯酶，所得固定化酶的酶活力回收率為91%，但在重復使用12次后，其相對活性就降到50%以下；隨后，NGUYEN等[26]用活性炭顆粒吸附漆酶后所得固定化酶循環(huán)使用12次后，可保留初始活性的71%；本實驗室前期制備的交聯磷脂酶D聚集體，在最適條件下的酶活力回收率高達118.8%，但重復使用10次后，僅保留50.4%的初始活性[27]。這些結果都說明吸附-交聯固定化所得的S-CLEAs-GA不僅具有較高的催化活性，且優(yōu)異的操作穩(wěn)定性使其在實際生產中具有更強的競爭力。

圖9 固定化酶S-CLEAs和S-CLEAs-GA的重復使用性Fig.9 Reusability of S-CLEAs and S-CLEAs-GA

3 結論

本文以硅納米粒子為載體，戊二醛為交聯劑，利用吸附法和吸附-交聯法固定化蔗糖異構酶，得到S-CLEAs和S-CLEAs-GA兩種固定化酶。在酶加量為8.6 U/mL、吸附時間為5 h時，S-CLEAs的最大酶活力回收率為51.2%；隨后加入0.08%的戊二醛、交聯2 h后，得到的S-CLEAs-GA的最大酶活力回收率為44.9%。固定化酶表現出優(yōu)異的的熱穩(wěn)定性和pH耐受性，且S-CLEAs-GA的穩(wěn)定性優(yōu)于S-CLEAs。在重復使用15次后，S-CLEAs和S-CLEAs-GA仍然能夠保持55%以上的初始酶活力。表明此方法得到的固定化酶擁有良好的酶活力回收率和操作穩(wěn)定性，其性能遠優(yōu)于游離酶，具有良好的發(fā)展前景。