王廣，李德嫻，張永濤，鄒家浩，李雪清，袁宇欣，余夢琦，陳璐，李廣

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，奶羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新實驗室，楊凌 712100）

隨著現(xiàn)代化畜牧業(yè)集約化發(fā)展，人工授精技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。奶山羊精液冷凍保存有助于良種奶山羊精液長期保存留種和跨地域運輸，有助于加速奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展進程，提高經(jīng)濟效益。然而，薩能奶山羊精液冷凍保存的研究存在解凍后精子活力低、受胎率低等問題。薩能奶山羊冷凍精液尚未廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，精子在冷凍保存過程中，會因溫度的變化受到不可逆的損傷，從而降低精子受精率。因此，篩選最適宜的奶山羊精液冷凍程序是非常有必要的。

眾所周知，精液質(zhì)量是影響人工受精效果的關(guān)鍵因素之一，而精液冷凍程序?qū)τ诮鈨龊缶夯盥示哂兄匾挠绊?。精子凍融后的存活主要取決于能否將細(xì)胞內(nèi)冰晶形成減少到最低程度。理論上精子的冰點為-0.6℃，造成精子損害的溫度為冰點至-60℃，精子進入冰點以下，就會形成冰晶，造成精子損害[1]。在-0.6～-10℃，由于甘油冷凍保護劑的作用，在冰點時可以快速通過，且對精液質(zhì)量損傷較小。若使用快速的降溫速率或者使用適當(dāng)?shù)谋鶅隼鋬鰟?，使精子迅速地跨過冰點至－60℃之間，可減少冰晶形成對精子的損害[1]。國內(nèi)外研究表明，在危險區(qū)間內(nèi)，人、牛和豬精液最佳降溫速率分別為1～10/min、35℃/min和30℃/min[2～7]。目前尚未見到薩能奶山羊程序化冷凍的相關(guān)研究，因此，本試驗利用不同冷凍程序，旨在找出薩能奶山羊凍精在危險區(qū)間內(nèi)的最佳降溫速率。

1 材料和方法

1.1 動物

本試驗選用薩能奶山羊為試驗動物。所用精液取自陜西省寶雞市隴縣和氏羊場2.5～3歲的6只薩能奶山羊，身體健康，性欲旺盛。體外人工受精所用母羊為平均年齡在1.8～2.5歲體況良好的薩能奶山羊，該試驗在2021年4-12月期間進行。

1.2 采精

采用人工陰道法收集奶山羊精液。收集精液后，立即將其置于37℃保溫杯中送往實驗室，并在37～38℃下對精子樣品進行精子密度和精子活力評估。精子形態(tài)正常，畸形率小于5%，精子活力在0.75以上，每毫升密度大于15億的精液樣本可用于后續(xù)試驗。

1.3 精液處理

經(jīng)顯微鏡檢查的精液分為5個試驗組（表1），對試驗組A、B、C、D、E組進行不同冷凍程序處理，鏡檢精子活力后加入稀釋Ⅰ液（乳糖46g/L、葡萄糖4g/L、檸檬酸鈉15g/L），置于4℃冰箱2h。然后在4℃操作臺中按照稀釋Ⅱ液配方（Ⅰ液＋6%甘油）進行第二次等溫稀釋，在4℃冰箱中繼續(xù)平衡1.5h，第二次平衡完成后，將精液注入0.25ml細(xì)管。根據(jù)5種不同程序?qū)囟冉抵?140℃。精液溫度下降至-140℃時即為冷凍結(jié)束，保持30s后立即取出細(xì)管浸入液氮中，完成冷凍過程[7]。冷凍1h后，將樣品在38℃水浴中解凍40s，檢測精子活力、質(zhì)膜完好率、頂端體完整率。

表1 不同冷凍程序?qū)踊盍Φ挠绊?/p>

1.4 精子評估

1.4.1 精子活力

精液樣本通過計算機輔助精子分析（CASA）系統(tǒng)評估精子活力參數(shù)。測試了以下參數(shù)：總運動（TM）、漸進運動（PM）、平均路徑速度（VAP）、直線速度（VSL）、曲線速度（VCL）、線性（LIN）、節(jié)拍交叉頻率（BCF）。

1.4.2 精子質(zhì)膜的功能

用超滲精子腫脹（HOST）方法測試質(zhì)膜的完整性，首先將解凍的精液與低聚子果糖和檸檬酸鈉溶液混合，在37℃下孵化60min。相差顯微鏡放大1 000倍觀察樣品。如果精子質(zhì)膜完好，精子頭部會吸水膨脹，尾部會膨脹卷曲[8]。通過一種特異性的熒光探針(異硫氰酸酯標(biāo)記的花生凝集素、FITC-PNA)檢測到頂體的完整性。具體的方法是：在37℃條件下，將解凍的精子樣本與試劑盒中的ethD-1完全混合15min。將5μL混合物放入玻璃滑梯上，加入95%乙醇30s，然后加入15μL FITC-PNA溶液，在4℃反應(yīng)30min，然后由PBS去除[9]。利用熒光顯微鏡（CX-31，日本東京奧林巴斯）在放大1 000倍下評估頂體完整性，在5個不同的區(qū)域評估200個精子。

1.5 體外受精和胚胎發(fā)育

1.5.1 卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)

在屠宰場收獲沒有可見黃體的山羊卵巢，并置于添加抗生素的生理鹽水中運輸?shù)綄嶒炇?。收集的卵巢在無菌生理鹽水中洗滌3次，在添加有10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌2次。使用一次性注射器從中等大小的卵泡（直徑3～6mm）中吸取卵母細(xì)胞。選擇具有至少三層完整且致密的卵丘細(xì)胞和均勻顆粒狀細(xì)胞質(zhì)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)在體視顯微鏡下進行體外培養(yǎng)至成熟。然后將COC在DPBS中洗滌3次，在成熟培養(yǎng)基中洗滌2次，并在38.5℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)27h。選擇具有膨脹積云的COC用于隨后的體外受精。

1.5.2 體外受精前的精子處理

取約100μL解凍精液，用5mL精子BO培養(yǎng)基稀釋，25℃、1 200r/min離心5min。丟棄上清液并將精子顆粒重新懸浮在同一介質(zhì)中。重復(fù)此步驟3次以去除所有精漿。將所得精子沉淀重懸在BO培養(yǎng)基中，并在含有50μg/mL肝素的BO培養(yǎng)基中按1:1稀釋。精子在38.5℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h，直到用于體外受精。

1.5.3 體外受精

體外成熟27h后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到100μL BO培養(yǎng)基（石蠟油下）中，將獲能的精子懸浮液加入液滴中，使精子終濃度達到5×106個活細(xì)胞/mL。置于38.5℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中24h進行體外受精。

1.5.4 體外胚胎培養(yǎng)

受精后24h，清洗假定的受精卵以分離黏附的精子細(xì)胞。將假定的受精卵置于CO2培養(yǎng)箱中，在38.5℃、CO2濃度為5%的環(huán)境中，在胚胎發(fā)育培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和3mg/mL牛血清白蛋白的mCR2aa培養(yǎng)基）中培養(yǎng)9d。

1.5.5 體外胚胎發(fā)育評價

授精后，每48h向一半培養(yǎng)基補充新鮮培養(yǎng)基。在倒置相差顯微鏡下對胚胎進行形態(tài)學(xué)評估。受精后48h測定卵裂率，胚胎培養(yǎng)第9天測定胚泡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS22.0進行統(tǒng)計分析。試驗組每組6個重復(fù)，采用方差分析(ANOVA)和T檢驗定位差異，比較了精液質(zhì)量和運動參數(shù)、質(zhì)膜完整性和頂體完整性、受精率。P〈0.05時為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊精液解凍后精子活力的影響

由表2可見，解凍后，使用冷凍程序C組的精子運動性能相關(guān)參數(shù)顯著高于其他組（P〈0.05）。在多個質(zhì)量參數(shù)中，使用冷凍程序B組和D組之間無顯著差異（P＞0.05），但它們的TM、VSL、LIN參數(shù)明顯高于A組和E組（P〈0.05）。

表2 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊精液解凍后精子活力的影響

2.2 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊精液解凍后精子質(zhì)膜功能的影響

由表3可見，解凍后，使用冷凍程序C組的頂體完整性和質(zhì)膜完整性明顯高于其他組（P〈0.05）。使用冷凍程序B組和D組之間無顯著差異（P＞0.05），且與A組和E組無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊精液解凍后精子質(zhì)膜功能的影響

2.3 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育的影響

由表4可見，體外受精48h后測定的卵裂率，冷凍程序C組顯著高于其他4組（P〈0.05）。在胚胎培養(yǎng)第9天測量的囊胚率，冷凍程序C組也顯著高于其他4組（P〈0.05）。

表4 不同冷凍程序?qū)λ_能奶山羊卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育的影響

3 討論

在精子冷凍過程中，存在冰晶損傷、敏感溫度變化、稀釋液滲透壓變化、稀釋液成分變化和離心處理等諸多問題。目前，在薩能奶山羊細(xì)管凍精研究上，程序化冷凍曲線的篩選處于空白階段。降溫速度過慢，精子因不能耐受物理溫度而死亡；降溫速度過快，精子的代謝活動增強，但存活的時間縮短[10]。因此，冷凍程序的篩選對于精液的冷凍保存非常重要。

本研究首次在薩能奶山羊全自動細(xì)管凍精上使用不同冷凍程序，闡明了在精液冷凍保存過程中最佳程序冷凍曲線對提高薩能奶山羊精液質(zhì)量的重要性。從試驗結(jié)果來看，利用冷凍程序C組可以顯著提高精子活力和質(zhì)膜功能的完整性。精子活力與生殖效率密切相關(guān)，精子解凍后的運動能力是冷凍保存和人工受精的重要預(yù)測指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，在-10～-140℃降溫速率達到40℃min時精子解凍后的運動性能顯著提高。降溫速度是影響液態(tài)保存精液精子活力的主要因素，降溫速度過快會降低精子活力，但是過慢甚至不降溫，精子活力也會隨保存時間的延長而衰減。在盡可能減少對精子影響的前提下盡量縮短降溫過程是精液保存中的理想做法[11]。精子的質(zhì)膜和頂體的完整性能夠直接影響精子的受精能力。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)使用冷凍程序C組時，解凍后精子的質(zhì)膜和頂體完整性得到顯著改善。同樣，對戴瑞羊的研究也證實，最適的降溫速率可以改善精子質(zhì)膜功能[12]。體外受精試驗可以直觀地反映精子的受精能力，卵裂和囊胚階段是胚胎發(fā)育的重要時期。通過比較在-10～-140℃危險溫區(qū)內(nèi)設(shè)置的5個不同降溫速率，可以看出冷凍程序C組的降溫速率不會對精子受精能力產(chǎn)生負(fù)面影響，相反可提高精子活力和精子形態(tài)，顯著提高精子受精率。在本研究中發(fā)現(xiàn)在薩能奶山羊細(xì)管凍精過程中，精液在冷凍過程中有效避開形成冰晶的危險區(qū)域極其重要[13]，不當(dāng)?shù)睦鋬霰４娉绦蚩赡茉斐梢l(fā)精子在母畜生殖道內(nèi)運動受損和生存率差等后果[14]。通過電腦編輯冷凍程序，控制冷凍溫度變化，進而為研究冷凍溫度變化曲線和精子活力變化提供參考。在制備薩能奶山羊細(xì)管凍精時，在-10～-140℃溫區(qū)，降溫速率應(yīng)控制在40℃/min，從程序儀將細(xì)管凍精取出后直接投入液氮，這樣精子就可以處于超低溫狀態(tài)下，抑制了精子的代謝活動，使其能量消耗停止，這樣精液可以長期保存。

4 結(jié)論

綜上所述，在薩能奶山羊全自動細(xì)管凍精制作上，程序化冷凍曲線使用起始溫度5℃；5～-10℃，降溫時間150s（降溫速率6℃/min）；-10～-140℃，降溫時間195s（降溫速率40℃/min）冷凍精液效果更好，可有效保證精子活力和質(zhì)膜功能，提高解凍后精液質(zhì)量。