朱文博，趙凌燕，王敏思，宋 洋

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

克百威（carbofuran）屬于氨基甲酸酯類(lèi)殺菌劑，具有高效、低殘留的特點(diǎn)以及內(nèi)吸、觸殺、胃毒等一定的殺卵作用，可防治多種害蟲(chóng)、螨類(lèi)和線(xiàn)蟲(chóng)，還可通過(guò)縮短作物生長(zhǎng)期來(lái)提高作物產(chǎn)量，因此以往被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[1].近年來(lái)克百威被限制使用：一方面，由于克百威的持效期和半衰期較長(zhǎng)，因此易造成環(huán)境污染；另一方面，克百威會(huì)使膽堿酯酶失活，造成機(jī)體組織中乙酰膽堿大量蓄積從而導(dǎo)致中毒[2].我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2016）[3]中規(guī)定了克百威的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中水果的最大殘留限量（MRL）不得超過(guò)0.02 mg/kg.歐盟規(guī)定蘋(píng)果和柑橘類(lèi)水果中克百威的MRL分別為0.001和0.01 mg/kg[4].但目前仍有生產(chǎn)者將克百威作為隱性成分非法添加到農(nóng)藥產(chǎn)品中，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中的克百威超標(biāo)，嚴(yán)重危害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全.

現(xiàn)今常用的克百威殘留分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）及酶聯(lián)免疫法（ELISA）等.儀器方法雖然可以準(zhǔn)確測(cè)定多種藥物，但繁瑣費(fèi)時(shí)，需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程、昂貴的儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的操作人員，檢測(cè)成本高，難以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品的需要.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法由于具有特異性強(qiáng)、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)，適用于復(fù)雜體系基質(zhì)中痕量組分的分離或檢測(cè)，已成為許多國(guó)家檢測(cè)農(nóng)藥殘留的首選方法.近年來(lái)，已有一些針對(duì)果汁、茶葉、水果等農(nóng)產(chǎn)品中克百威殘留快速檢測(cè)研究的報(bào)道，如Mickova等[5]基于單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC/ESI/MS/MS）法，測(cè)定嬰兒水果食品中的克百威、西維因和甲硫威，ELISA中克百威的方法檢測(cè)限（LOD）為0.3 μg/kg，樣品的添加回收率為60%～100%，檢測(cè)時(shí)間在4 h以?xún)?nèi)；何方洋等[6]基于篩選的克百威單克隆抗體，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)蔬菜及茶葉中的克百威殘留，檢測(cè)限分別為10 μg/L和5 μg/L，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為2.3 μg/L，加標(biāo)回收率為79.2%～102.7%，檢測(cè)時(shí)間僅為1.5 h；Lan等[7]基于廣譜特異性單克隆抗體建立了可同時(shí)檢測(cè)水果和蔬菜中克百威與3-羥基克百威的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，檢測(cè)限為0.03 μg/L，IC50為0.76 μg/L，檢測(cè)時(shí)間約為2.5 h，相較于其他方法，該方法檢測(cè)限更低，能更好地滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室食品樣品中克百威含量的檢測(cè)要求.

為了獲得更為簡(jiǎn)單、快速、高效、靈敏的檢測(cè)方法，本研究基于單克隆抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)生物素/親和素酶聯(lián)免疫分析方法（biotin/avidin-enzyme-linked immunosorbent assay，BA-ELISA），消除食品樣品中基質(zhì)的影響并且對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，使其更加簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，從而實(shí)現(xiàn)水果及水果制品中克百威殘留的高效檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Labsystems），美國(guó)雷勃公司；96孔酶標(biāo)板，丹麥Nunc公司.

試劑：克百威、克百威抗原、單克隆抗體，山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（SA-HRP）、生物素化羊抗兔IgG（B-Ab2）、過(guò)氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），美國(guó)Sigma公司.

1.2 間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA方法

向酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加入100 μL經(jīng)包被液（pH值為9.6的碳酸鈉緩沖液）適當(dāng)稀釋的抗原，室溫下包被過(guò)夜（或37℃包被3 h）.棄去孔內(nèi)溶液，利用洗液（1 L PBS+0.5 g吐溫）洗板3次，加入200 μL封閉液（含0.5%脫脂奶粉的PBS），室溫下封閉1 h，棄封閉液，洗板3次，加入待測(cè)樣（或梯度稀釋的標(biāo)樣）和抗體各100 μL，同時(shí)設(shè)置空白組（不加標(biāo)樣或待測(cè)樣以及抗體）和對(duì)照組（不加標(biāo)樣或待測(cè)樣），37℃孵育20 min，洗板4次.每孔加100 μL稀釋后的IgG（B-Ab2），37℃孵育20min，洗板4次.每孔加100 μL稀釋后的SA-HRP，37℃孵育10 min，洗板5次.每孔中加150 μL現(xiàn)配制的底物，顯色20 min，利用酶標(biāo)儀讀取A450和A650.

將包被原稀釋?zhuān)姑靠字械馁|(zhì)量分別為0.1、0.5和1.0 μg.用離子濃度分別為10、20、30 mmol/L，pH值分別為5.5、6.5、7.4、8.5的磷酸鈉緩沖液稀釋生物素化羊抗兔抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素及克百威標(biāo)準(zhǔn)品，孵育時(shí)間分別設(shè)為30、45、60 min，利用酶標(biāo)儀讀取A450和A650，計(jì)算IC50以確定最佳條件.

配制含量分別為0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 μg/L的克百威標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用BA-ELISA對(duì)其進(jìn)行測(cè)定.以克百威標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/L）為橫坐標(biāo)，以抑制率（%）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

式中：A空白為空白孔的吸光度；A對(duì)照和Ax為含量分別為0和x時(shí)克百威標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度.

1.3 抗體特異性評(píng)價(jià)

以交叉反應(yīng)率（CR）作為評(píng)判抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)[8].

式中：IC50(克百威)為克百威抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的克百威含量；IC50(其他標(biāo)準(zhǔn)品)為其他標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品含量.

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 樣品處理

選用蘋(píng)果、蘋(píng)果汁、橙子、橙汁作為樣品來(lái)評(píng)估間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA法的性能和指標(biāo)，水果及水果制品均來(lái)自于市售.

水果樣品：稱(chēng)取2.0 g粉碎后的樣品，向其中加入4 mL乙腈和1 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，離心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液進(jìn)行旋蒸，加入1 mL甲醇復(fù)溶，置于4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?

果汁樣品：取2 mL樣品，加入4 mL乙腈和1 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min，離心5 min（4 000 r/min），吸取2 mL上清液進(jìn)行旋蒸，加入1 mL甲醇復(fù)溶，置于4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.4.2 消除基質(zhì)影響

為了減少基質(zhì)的影響，將處理好的樣品提取液分別用添加了魚(yú)皮膠（FG）、牛血清蛋白和表面活性劑等基質(zhì)掩蔽劑的PBS稀釋液進(jìn)行處理，再采用BA-ELISA法進(jìn)行測(cè)定[9].

1.4.3 添加回收實(shí)驗(yàn)

本研究通過(guò)對(duì)蘋(píng)果、蘋(píng)果汁、橙子、橙汁4種樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)BA-ELISA方法的準(zhǔn)確度.樣品提取液分別添加不同質(zhì)量的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其終含量分別為10、20和40 μg/kg（每個(gè)含量重復(fù)3次），進(jìn)行BA-ELISA實(shí)驗(yàn)并計(jì)算回收率.

1.4.4 盲樣檢測(cè)

取4種水果及其制品共12件空白樣品，編號(hào)1#～12#，隨機(jī)添加克百威標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣用于BA-ELISA和氣相色譜法（GC）檢測(cè).

1.4.5 方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[10]，樣品提取方法同1.4.1，處理后的樣品提取液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，之后用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 BA-ELISA方法的建立

對(duì)抗原包被量、PBS緩沖液的濃度和pH值、稀釋倍數(shù)、孵育時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件為：包被原的包被量為每孔0.5 μg，緩沖液濃度為10 mmol/L、pH值為7.4，IgG（B-Ab2）和SA-HRP均稀釋5 000倍，IgG（B-Ab2）孵育時(shí)間為20 min，SA-HRP孵育時(shí)間為10 min.繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示.由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可得，IC15=（0.082±0.002）μg/L，IC50=（0.265±0.010）μg/L，線(xiàn)性范圍為0.12～2.10 μg/L.通過(guò)該方法得到的克百威檢出限遠(yuǎn)低于我國(guó)及一些歐盟國(guó)家所規(guī)定的MRL值.

圖1 克百威抑制曲線(xiàn)Fig.1 Carbofuran inhibition curve

2.2 特異性評(píng)價(jià)

選擇與克百威結(jié)構(gòu)類(lèi)似的其他化合物進(jìn)行交叉反應(yīng)率測(cè)試，從而對(duì)抗體特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1所示.

表1 各化合物與抗體的IC50和CR值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，同屬于氨基甲酸酯類(lèi)殺菌劑的異丙威、速滅威、滅多威和甲萘威的交叉反應(yīng)率均低于0.01%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中的抗體具有很好的特異性，能夠?qū)Ｒ恍詸z測(cè)克百威.抗體與丁硫克百威的交叉反應(yīng)率為0.02%，可能是由于丁硫克百威容易降解為克百威，因此對(duì)抗體有一定的親和性.

2.3 克百威BA-ELISA的校正曲線(xiàn)及基質(zhì)曲線(xiàn)

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最終確定使用0.5%的FG-PBS緩沖液對(duì)處理后的水果及果汁樣品提取液稀釋20倍，采用BA-ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，所得抑制率曲線(xiàn)即為樣品的基質(zhì)曲線(xiàn)，如圖2所示.

圖2 克百威BA-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 BA-ELISA calibration curve of Carbofuran

由圖2可以看出，4種樣品的基質(zhì)曲線(xiàn)及吸光值曲線(xiàn)基本上能和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)重合，說(shuō)明該樣品前處理方法能夠基本消除基質(zhì)影響.

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

分別在蘋(píng)果、蘋(píng)果汁、橙子、橙汁的20倍稀釋樣品提取液中添加克百威標(biāo)品，使其最終含量分別為10.00、20.00和40.00 μg/kg，每組設(shè)置3個(gè)平行，分別采用BA-ELISA方法和GC方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算OD值得到回收率，結(jié)果如表2所示.

表2 克百威在4種樣品中的添加回收率Tab.2 Recovery of Carbofuran in four kinds of samples

由表2可知，4種樣品采用BA-ELISA方法得到的克百威添加回收率為90.20%～99.83%，變異系數(shù)（CV）為1.8%～6.3%，同GC方法得到的結(jié)果基本一致.

2.5 盲樣檢測(cè)結(jié)果

將蘋(píng)果、蘋(píng)果汁、橙子、橙汁4種水果及其制品共12件空白樣品編號(hào)為1#～12#，隨機(jī)添加克百威標(biāo)準(zhǔn)品制成盲樣，采用本研究建立的間接競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA法檢測(cè)克百威含量，以GC法檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)照，如表3所示.由表3可知，最終檢測(cè)出陽(yáng)性樣品共5件，其中蘋(píng)果2件、蘋(píng)果汁1件、橙子2件，其檢測(cè)結(jié)果與GC方法檢測(cè)結(jié)果基本一致.

表3 分別采用BA-ELISA和GC方法得到的盲樣中克百威的含量Tab.3 Carbofuran content in blind samples detected by BA-ELISA and GC method respectively

3 結(jié)論

本研究基于克百威單克隆抗體建立了簡(jiǎn)單、高效、靈敏的BA-ELISA方法，可用來(lái)檢測(cè)水果及其制品中的克百威殘留.樣品僅需經(jīng)過(guò)乙腈提取，提取液用0.5%的FG-PBS稀釋20倍即可基本消除基質(zhì)影響.采用BA-ELISA方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間只需1 h，實(shí)現(xiàn)了對(duì)克百威殘留的快速、高效檢測(cè).本實(shí)驗(yàn)所建立的BA-ELISA方法檢測(cè)限為（0.082±0.002）μg/L，靈敏度為（0.265±0.010）μg/L，水果及其制品的最低檢出限是0.25 μg/kg，遠(yuǎn)低于我國(guó)及一些歐盟國(guó)家所規(guī)定的MRL（0.02 mg/kg）的標(biāo)準(zhǔn).以GC方法作為對(duì)照，BA-ELISA方法對(duì)水果及其制品中克百威含量的檢測(cè)結(jié)果與其基本一致，證實(shí)該方法準(zhǔn)確可靠.與常用方法相比，BA-ELISA法所需時(shí)間更短，檢出限更低，可作為一種高效靈敏準(zhǔn)確的水果及其制品中克百威殘留的檢測(cè)手段.