鐘 雪，李 倩，宋 昱，王惠國，唐勁天

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.清華大學(xué)工程物理系，北京 100084）

桑樹（Morus alba L.）屬?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.），果實(shí)桑葚每年4—6月份成熟，是一種藥食兩用的水果.桑葚中含有大量的維生素、氨基酸、有機(jī)酸、微量礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，還含有白藜蘆醇、花青素、多糖、萜類化合物、生物堿、揮發(fā)油類等化合物.研究[1-3]表明，桑葚具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗衰老、降血糖、降血壓、增強(qiáng)免疫力、抗病毒以及抗炎等作用.Huang等[4]報(bào)道，桑葚能夠在一定程度上通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制胃癌的增殖和生存；Ou等[5]研究發(fā)現(xiàn)，桑葚提取物可通過AMPK（AMP-activated protein kinase）途徑減少脂質(zhì)積累，抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸氧化；Hsu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，桑葚可通過降低脂質(zhì)過氧化和抑制促炎基因的表達(dá)對CCL4誘導(dǎo)的肝損傷和纖維化起到保護(hù)和治療作用.盡管桑葚有十分豐富的生物活性，但具體的藥理作用及作用途徑、靶點(diǎn)等尚不明確.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)極大程度上否定了藥物對應(yīng)單一靶點(diǎn)、單一疾病的理論，尤其是中藥組方.構(gòu)建藥物與藥物、藥物與靶點(diǎn)、藥物與疾病的網(wǎng)絡(luò)體系，在大數(shù)據(jù)的支持下解釋藥物作用于人體這個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制，從宏觀整體的角度預(yù)測藥物多成分和多靶點(diǎn)、多通路的關(guān)系是當(dāng)前藥物研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[7].如王佳俊等[8]基于現(xiàn)代信息技術(shù)，分析了含黃連方劑治療UC的配伍規(guī)律，并且在分子水平上揭示了含黃連核心藥物組治療UC的機(jī)制；秦曉寬等[9]通過文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討了高頻組合中藥治療腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制；Santbergen等[10]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究了芍藥甘草湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制.

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫中搜集桑葚含有的化合物并加以篩選，對篩選出的有效化合物進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，尋找到最可能的藥理作用和分子機(jī)制，為生物工業(yè)化生產(chǎn)、醫(yī)藥學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)提供更好的方向和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 桑葚網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

使用中國知網(wǎng)（https：//www.cnki.net/）、維普（http：//www.cqvip.com/）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺（http：//www.wanfangdata.com.cn/index.html）、PubMed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）等數(shù)據(jù)庫，在所有發(fā)表的文獻(xiàn)當(dāng)中搜集桑葚內(nèi)含有的化合物.

1.2 桑葚有效化合物的篩選

利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），對得到的所有化合物進(jìn)行分析比對，去除重復(fù)化合物，并保存SDF或mol2格式的3D分子結(jié)構(gòu)圖.設(shè)置篩選條件：口服生物利用度≥30%（oral bioavailability，OB），類藥性≥0.18（drug likeness，DL）.OB在評估藥物和食品成分通過腸屏障的吸收和運(yùn)輸中至關(guān)重要[11]，類藥性是依據(jù)藥物的要求評價所查化合物與現(xiàn)有的已知藥物的相似性.

1.3 桑葚有效化合物靶點(diǎn)及蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過STITCH version 6.0[12]（http：//stitch.embl.de/）、Swiss Target Prediction[13]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和UniProt[14]（https：//www.uniprot.org/）檢索上述篩選到的潛在化合物，尋找到它們對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白的Uniprot ID和ChEMBL ID，選擇Probability*＞0.5、combined score＞0.5的蛋白，同時篩除重復(fù)的靶點(diǎn)蛋白并進(jìn)行整理.利用String（https：//string-db.org/）和Cytoscape[15]軟件進(jìn)行蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作分析.

1.4 GO富集分析和KEGG通路注釋分析

將整理好的靶點(diǎn)蛋白的信息用DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）進(jìn)行富集分析[16].選擇“Homo sapiens”，將置信度評分設(shè)置為≥0.4定義為顯著，下載數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel表格，同時用R語言將得到的信息可視化.

1.5 靶點(diǎn)分子對接

將蛋白互作分析出的最具有可能性的蛋白輸入PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，選擇分辨率最好的蛋白晶體結(jié)構(gòu)下載，得到編號為6BFJ.利用Schrodinger suite 2017軟件對靶蛋白與小分子的相互作用方式進(jìn)行對接研究[17].

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚中主要化合物的分析

通過搜集文獻(xiàn)，得到桑葚中含有的所有化合物，去除重復(fù)，共得到64種化合物，包括蘆丁、槲皮素、異槲皮素、二氫槲皮素、白藜蘆醇、原兒茶素、矢車菊素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、花青素、花色苷、咖啡酸、黃芪苷、桑黃素、楊梅酮、山奈酚、天竺葵-3-O-蕓香糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、DNJ、D-焦谷氨酸乙酯、3-O-咖啡?？鼘幩峒柞?、維生素C、維生素A、磺胺素、核黃素、尼克酸、精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、麥芽糖、甘露糖、甲基庚烯酮、脯氨酸、鼠李糖、絲氨酸、組氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、甘露醇、天門冬氨酸、阿拉伯糖、丙氨酸、海藻糖、半乳甘露聚糖、半乳糖、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、長葉烯、天竺葵醛、月桂醛、癸醛、二十二烯、琥珀酸酐、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、己酸、2，4-二甲基己烷、2-甲基十三烷、丁香酚、正十六烷.這些化合物主要為單糖、氨基酸類、脂肪酸類、黃酮類、甾醇類、香豆素類、揮發(fā)油類、多酚類、花青素類等.

2.2 桑葚化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的條件對64種化合物進(jìn)行篩選，共得到5種具有生物活性的化合物，分別為二氫槲皮素、黃芩苷、桑黃素、楊梅酮和山奈酚，如表1所示.

表1 桑葚的5種活性成分Tab.1 Five active compounds in mulberry

2.3 有效化合物的靶點(diǎn)及蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

5種潛在化合物共有71個靶點(diǎn)蛋白，具體如表2所示.將71個靶點(diǎn)輸入到String中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作研究，根據(jù)“degree”和“combined score”計(jì)算設(shè)置蛋白的顏色和大小，得到網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，即蛋白之間的生物相關(guān)性，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，去除游離的蛋白靶點(diǎn)（P＜1.0×10-16）后，一共得到71個節(jié)點(diǎn)240條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.76.將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，繪制出關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白互作圖.通過“degree”算法發(fā)現(xiàn)，caspase-3（degree=27）具有最高的節(jié)點(diǎn)數(shù)，caspase-3是caspase蛋白酶家族一員，是細(xì)胞凋亡過程中重要的終末剪切酶；其次是PTGS2（degree=26），PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，也是一種重要的炎性介質(zhì)，與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)，降低PTGS2的活性可能會抑制腫瘤細(xì)胞增殖[18]；第3位基因是ESR1（degree=24），它位于6q25染色體上，是雌激素受體，主要生理作用是刺激促性腺激素分泌、調(diào)節(jié)卵泡生成等，有研究[19]表明ESR1的表達(dá)和突變與乳腺癌密切相關(guān).

圖1 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作Fig.1 Protein network interaction

表2 桑葚潛在作用靶點(diǎn)Tab.2 Information of potential targets from mulberry

2.4 靶點(diǎn)GO富集分析和KEGG通路分析

靶點(diǎn)蛋白的DAVID富集分析結(jié)果如圖2所示.圖2列出了含有基因數(shù)最多的前15條通路，Q值均小于0.05，數(shù)值越小表示相關(guān)越具有顯著性.圖中顏色代表-lgQ，顏色越紅代表數(shù)值越高，說明與該通路相關(guān)性越高；點(diǎn)的大小表示含有基因數(shù)的多少，點(diǎn)越大對應(yīng)的基因數(shù)目越多.由圖2可以看出，桑葚中的化合物在代謝途徑（metabolic pathways）這條通路含有基因數(shù)量最多，其次是癌癥途徑（pathways in cancer）、甾類激素生物合成途徑（steroid hormone biosynthesis）、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑（pentose and glucuronate interconversions）、化學(xué)致癌作用途徑（chemical carcinogenesis）、癌癥中的microRNAS（microRNAs in cancer）等.細(xì)胞成分主要集中在cytoplasm、membrane和cytoplasmic part.分子功能主要集中在binding、catalytic activity和ionbinding.這些極有可能是通過cellular process、metabolic process以及organic substance metabolic process等生物過程進(jìn)行的.

圖2 GO和KEGG富集通路分析Fig.2 Analysis of GO and KEGG enrichment pathways

2.5 靶點(diǎn)分子對接

將篩選到的5種化合物分別與caspase-3蛋白對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有最高的得分.黃芩苷與caspase-3蛋白的分子對接結(jié)果如圖3所示.

圖3 分子對接Fig.3 Molecular docking

由圖3可以看出，黃芩苷可很好地進(jìn)入caspase-3蛋白氨基酸殘基形成的疏水口袋，表明其與caspase-3具有良好的親和力.在作用方式上，由圖3（a）可知，黃芩苷可與caspase-3蛋白中的Hie121、Ser120、Gln161、Thr166、Thr625個氨基酸殘基形成氫鍵作用，與Ala162、Cys163、Trp206、Tyr204、Phe128以及Met61形成疏水作用，與Hie121形成ππ共軛作用（π-πstacking），與Arg64、Arg207以及Gln123形成靜電作用.進(jìn)一步印證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)互作的篩選結(jié)果.

3 討論與結(jié)論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對桑葚的成分、相關(guān)靶點(diǎn)分子功能、細(xì)胞組成、生物過程和KEGG通路進(jìn)行富集分析，最后通過分子模擬及分子對接方法驗(yàn)證了化合物和靶點(diǎn)分子互作的可靠性.從已發(fā)表文獻(xiàn)中共得到桑葚的64種化合物，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的條件從中篩選出5種具有生物活性的化合物，分別為二氫槲皮素、黃芩苷、桑黃素、楊梅酮、山奈酚，它們對應(yīng)了71個潛在的蛋白作用靶點(diǎn).蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果表明，caspase-3具有最高的節(jié)點(diǎn)數(shù).這些靶點(diǎn)富集出67條通路，其中多數(shù)與癌癥相關(guān)，包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌等.由富集分析結(jié)果可以推測，桑葚可能通過細(xì)胞凋亡、VEGF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路以及p53信號通路等影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.此外，桑葚有可能對阿爾茨海默癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脂肪的消化與吸收、膽固醇代謝、病毒性心肌炎等一些疾病存在潛在的影響.

從桑葚中得到的5種有效化合物中，黃芩苷與caspase-3靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的得分最高.Orzechowska等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有能夠影響B(tài)-急性淋巴細(xì)胞白血病不同染色體重排的抗腫瘤作用.劉莎莎等[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能通過凋亡抑制食管癌的發(fā)生和發(fā)展.黃芩苷還具有抗炎[21]、抑菌[22]、降血糖[23]等作用.本研究結(jié)果表明，黃芩苷與caspase-3靶點(diǎn)蛋白的親和力最好，可很好地進(jìn)入caspase-3蛋白氨基酸殘基形成的疏水口袋.caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分.

總的來看，根據(jù)蛋白功能預(yù)測分析，桑葚所含化合物與腫瘤治療有很大的相關(guān)性，尤其是化合物黃芩苷，能夠與靶點(diǎn)蛋白caspase-3很好地結(jié)合，后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新興的科技手段，還存有一定的局限性，數(shù)據(jù)資源平臺需要專人維護(hù)檢修，數(shù)據(jù)庫資源還需進(jìn)一步的擴(kuò)充和完備.本研究揭示了桑葚的多化合物、多靶點(diǎn)、多通路的生物學(xué)特點(diǎn)，整體上為研究其生物活性物質(zhì)提供了新的方法和思路.