王琪 黃臻輝

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

奧美拉唑作為質(zhì)子泵抑制劑，有較強的抑制胃酸作用，主要用于治療十二指腸潰瘍和卓-艾綜合征，也可用于胃潰瘍和反流性食管炎[1]。其療效優(yōu)于H2受體拮抗劑及前列腺素E2、硫糖鋁、膠體鉍及大劑量抗酸劑，可迅速改善消化性潰瘍和反流性食管炎的癥狀。由于中國藥典2020年版中尚未收入其微生物限度檢查項，故通過驗證確立其微生物檢查方法。

1 材料和方法

1.1 儀器

Sanyo MIR253恒溫培養(yǎng)箱、SANYO MLS-3750高壓蒸汽滅菌柜（三洋電機株式會社）；JY-5002型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆籋TY-601集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；ESCO ClassⅡBSC生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 樣品、培養(yǎng)基與試劑試液

奧美拉唑原料藥（批號YF1203003、YF1203008、YF1112017，分別簡稱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，浙江金華康恩貝生物制藥有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA批號201119）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA批號201119）（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基（TSA批號135025-201804）、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基（SDA批號135013-201703）（中國食品藥品檢定研究院）； 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB批號201112，默克化工技術(shù)（上海）有限公司）；0.2、0.1和0.01 mol/L無菌NaOH溶液，0.9%無菌NaCl溶液，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（均為實驗室自配，經(jīng)121 ℃、15 min滅菌后使用）。

1.3 菌種與菌液制備

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501、白色假絲酵母（Candida albicans）CMCC（F）98001、黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003菌種均由上海市食品藥品檢驗所提供。參照中國藥典2020年版四部通則1105的方法培養(yǎng)菌種，制備成菌懸液或孢子懸液。

1.4 驗證方法

1.4.1 培養(yǎng)基適用性檢查

采用涂布法，分別將1×103CFU/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母和黑曲霉0.1 mL涂布在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，將1×103CFU/mL的白色假絲酵母和黑曲霉0.1 mL涂布在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)[2-5]，每株試驗菌平行制備2個平皿。

1.4.2 供試品稀釋劑的選擇及供試液的制備

由于奧美拉唑不溶于水，分別選擇0.01、0.1、0.2 mol/L三個濃度的無菌NaOH溶液做溶解性試驗，挑選出適宜濃度的NaOH溶液作為稀釋劑，并確定該濃度溶液不會對試驗造成干擾[2-5]。按平皿法，取溶解性試驗確定后的濃度的無菌NaOH溶液10 mL，分別加入上述5種1×104CFU/mL的試驗菌株0.1 mL，混勻作為稀釋劑組。然后取1 mL分別傾注15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿。同法測定，用0.9%無菌NaCl溶液替代稀釋劑，加入相應(yīng)的試驗菌，作為菌液組。按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)后，取均值并計算回收率。

回收率=稀釋劑組菌落數(shù)/菌液組菌落數(shù)。

取每批供試品10 g加入到0.1 mol/L無菌NaOH溶液200 mL中，混勻后，作為1∶20供試液，進行3次獨立平行微生物限度檢查試驗。

1.4.3 平皿法

取供試液10 mL，分別加入上述5種1×104CFU/mL的試驗菌株0.1 mL，混勻。然后取1 mL分別傾注15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，按中國藥典2020年版四部通則1105規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)作為試驗組。同法測定，用0.9%無菌NaCl溶液替代供試液，加入相應(yīng)的試驗菌，作為菌液組；測定供試液本底菌菌落數(shù)，作為供試液對照組。培養(yǎng)后對菌落計數(shù)，取均值并計算回收率[5-9]。

回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組。

1.4.4 薄膜法

取1∶20供試液20 mL過濾（濾膜孔徑為0.45 μm），用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，沖洗量分別為50、100、150 mL，然后分別加入上述5種1×103CFU/mL的試驗菌0.1 mL，抽濾，取膜，貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上作為試驗組；同法測定，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，加入相應(yīng)的試驗菌，作為菌液組。按3個沖洗量測定供試液本底菌菌落數(shù)，作為供試液對照組。按中國藥典2020年版四部通則1105的規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，平行制備2個平皿。培養(yǎng)后對菌落計數(shù)，取均值并計算回收率[5-9]。

回收率=（試驗組菌落數(shù)-供試液對照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基適用性檢查

5種試驗菌在兩種培養(yǎng)基上的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)（表1、2），符合藥典規(guī)定，可用于供試品的方法適應(yīng)性試驗。

表1 培養(yǎng)基適用性檢查1

表2 培養(yǎng)基適用性檢查2

2.2 稀釋劑的選擇

選取批號為YF1203003的奧美拉唑1 g進行溶解性試驗，結(jié)果表明，其在0.1 mol/L的無菌NaOH溶液20 mL中溶解良好（表3），可作為奧美拉唑稀釋劑；各試驗菌在此濃度稀釋劑中的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，并確認其對各微生物均無生長抑制作用（表4）。

表3 奧美拉唑在不同濃度、不同體積NaOH溶液中的溶解性

表4 各試驗菌在稀釋劑中的回收率

2.3 平皿法試驗

采用平皿法進行驗證時，單從需氧菌總數(shù)方法適用性試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧美拉唑原料藥供試液對銅綠假單胞菌和白色假絲酵母的生長有明顯的抑制作用，而對其余3種試驗菌的生長均無抑制作用（回收率均在0.5～2的范圍內(nèi)）（表5），故需采用薄膜過濾法再次進行驗證。

表5 平皿法檢測各試驗菌在供試液中的回收率

2.4 薄膜法試驗

采用3種不同體積的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜后，5種受試微生物的回收率均在0.5～2的范圍內(nèi)（表6～8），表明薄膜法對微生物的生長均無影響。為盡量避免濾膜上的微生物可能受損傷，最終選擇最小沖洗量即50 mL/膜作為奧美拉唑微生物限度檢查的沖洗量。

表6 需氧菌（細菌）在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗

表7 需氧菌（真菌）在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗

表8 真菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的方法適用性試驗

3 討論

經(jīng)兩次試驗驗證，從平皿法試驗結(jié)果可以看出奧美拉唑?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和黑曲霉的生長均無抑制作用，但對銅綠假單胞菌和白色假絲酵母的生長有一定的抑制作用。采用薄膜法可消除其對一些微生物生長的抑制作用，表明薄膜法適用于奧美拉唑原料藥的微生物限度檢查[10]。

日常檢驗中，可用10 g奧美拉唑原料藥溶解于200 mL 0.1 mol/L的無菌NaOH溶液中，制成1∶20的供試液，取供試液20 mL，過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 mL沖洗濾膜，可去除奧美拉唑?qū)︺~綠假單胞菌和白色假絲酵母生長的抑制作用，使微生物限度試驗?zāi)苷＿M行。

我們的研究結(jié)果顯示，奧美拉唑?qū)︺~綠假單胞菌和白色假絲酵母生長有一定的抑制作用，但其確切的作用機理尚不明確，還有待繼續(xù)研究探索。