王玉芬，姚東作，馬海會(huì)，牛顏冰，王德富

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）為唇形科（Lamiaceae）黃 芩 屬（Scutellaria）多 年 生 草 本 植物[1]，以干燥根入藥，已有數(shù)千年的歷史。其化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、萜類(lèi)和多糖等，主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物，包括黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、含黃芩苷、野黃芩素和野黃芩苷[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，黃芩有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、保護(hù)腦組織、心腦血管和保肝等作用[4-5]，在臨床上多與其他藥物聯(lián)合使用。近年來(lái)，黃芩市場(chǎng)需求量大幅增長(zhǎng)，野生資源極度匱乏，不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，而人工栽培黃芩受遺傳和環(huán)境因素影響，其種質(zhì)差異較大，農(nóng)藥殘留，連作障礙，藥效成分含量偏低及其不穩(wěn)定性已成為黃芩栽培過(guò)程中的最大問(wèn)題[6]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種很好的替代途徑，自1902年HABERLANDTZ提出細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)以來(lái)，組織培養(yǎng)得到了迅速發(fā)展，技術(shù)也日趨完善[7]。通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)可以消除由遺傳差異帶來(lái)的影響，同時(shí)具備生長(zhǎng)周期短、代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)條件可調(diào)控、沒(méi)有外界環(huán)境條件限制等優(yōu)勢(shì)，已成為諸多藥用植物獲取天然藥用成分的途徑之一。高山林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩節(jié)間是誘導(dǎo)愈傷的最佳外植體，其次是節(jié)和葉片。齊香君等[9]以黃芩帶節(jié)莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)黑暗處理下愈傷組織顏色呈淡黃色，褐化率低，生長(zhǎng)良好。吳曉玲等[10]以黃芩的子葉、真葉和下胚軸為材料誘導(dǎo)黃芩愈傷組織，發(fā)現(xiàn)真葉為最佳外植體，MS+0.5 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最優(yōu)培養(yǎng)基。萬(wàn)貴香等[11]探究不同濃度外源激素的添加對(duì)黃芩愈傷組織中有效成分的影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加2，4-D會(huì)影響黃芩愈傷組織的生長(zhǎng)，且會(huì)加重褐化程度。

目前，關(guān)于黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)已有諸多報(bào)道，但大部分研究多采用的激素組合為6-BA和NAA，外植體也多選擇為莖段[12-13]。為進(jìn)一步探究2，4-D單獨(dú)或與其他激素組合使用在黃芩愈傷組織誘導(dǎo)中的作用及對(duì)根、莖段和葉片的誘導(dǎo)情況，本試驗(yàn)以黃芩根、莖段和葉片為材料，設(shè)立6-BA、NAA和2,4-D等3種激素不同濃度單因素及正交試驗(yàn)處理，探究6-BA、NAA和2，4-D單獨(dú)或復(fù)配對(duì)黃芩愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而篩選出適合黃芩愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方，旨在為黃芩等其他藥用植物愈傷組織誘導(dǎo)和優(yōu)化體系的建立提供一定經(jīng)驗(yàn)借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇生長(zhǎng)4周齡、長(zhǎng)勢(shì)良好的黃芩組培苗，取黃芩葉片（約0.5 cm2）、莖段（約1 cm）和根部（約1 cm）為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將處理好的黃芩外植體（葉片、莖段和根）分別接種于添加不同質(zhì)量濃度6-BA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和2，4-D（0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的MS固體培養(yǎng)基上，每個(gè)處理10皿，每皿接種5個(gè)外植體，3次重復(fù)。隨時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀況，14 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率并分析其生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 6-BA和NAA雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定6-BA、NAA兩激素的作用濃度范圍以及誘導(dǎo)黃芩外植體形成愈傷組織的最佳濃度，其因素水平如表1所示，共9個(gè)處理。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每個(gè)處理10皿，每皿接種6個(gè)外植體，3次重復(fù)。隨時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀況，28 d后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。

表1 6-BA和NAA試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 6-BA and NAA experimental design

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以6-BA、NAA和2，4-D為 條 件 進(jìn) 行3因 素3水 平L9（33）正交試驗(yàn)（表2），考察黃芩外植體在不同條件下的誘導(dǎo)情況，明確6-BA、NAA和2，4-D的不同水平對(duì)黃芩外植體（誘導(dǎo)率高的外植體）誘導(dǎo)的影響，篩選誘導(dǎo)黃芩外植體形成愈傷組織的最優(yōu)條件。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每個(gè)處理10皿，每皿接種5個(gè)外植體，3次重復(fù)。隨時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀況，28 d后統(tǒng)計(jì)黃芩愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Orthogonal design

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件處理，采用極差和方差分析各因素對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA、NAA、2,4-D愈傷組織誘導(dǎo)的單因素試驗(yàn)結(jié)果

在激素6-BA處理下（圖1-A），有且只有莖段在質(zhì)量濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L時(shí)可誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率分別為67.3%、87.3%和36.0%。在激素NAA處理下（圖1-B），莖段均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率分別為34.7%、63.7%、71.3%和72.0%；葉在低質(zhì)量濃度（0.5、1.0 mg/L）下可誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率分別為3.3%和4.9%，根仍無(wú)誘導(dǎo)發(fā)生。在激素2，4-D處理下（圖1-C），根、莖段和葉片均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，其中莖段誘導(dǎo)率顯著高于根和葉片，均高于90%；在0.1 mg/L時(shí)，莖段有最大誘導(dǎo)率，可達(dá)98.3%。

圖1 6-BA、NAA和2，4-D不同濃度對(duì)黃芩根、莖和葉的誘導(dǎo)率Fig.1 Induction rate of different concentrations of 6-BA，NAA，and 2，4-D on the roots，stems，and leaves of Scutellaria baicalensis

在激素6-BA處理下，黃芩愈傷組織呈淡黃色至黃棕色，并伴隨長(zhǎng)根和出芽現(xiàn)象。在NAA處理下，愈傷組織為淡黃色，黏性，分化程度較低，但在2.0 mg/L時(shí)已有褐化趨勢(shì)，結(jié)構(gòu)致密，為黃褐色，故此濃度不適合進(jìn)行誘導(dǎo)。在2，4-D處理下，低濃度下愈傷組織為乳白色，結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地較硬；隨濃度增加，顏色逐步加深，質(zhì)地逐步變軟，水漬化程度加深；在激素濃度為2.0 mg/L時(shí)，褐化程度最嚴(yán)重，呈灰褐色。綜上，結(jié)合愈傷組織誘導(dǎo)率及其生長(zhǎng)狀態(tài)，選用莖段為外植體，以1.0、1.5、2.0 mg/L的6-BA；0.5、1.0、1.5 mg/L的NAA和0.05、0.15、0.25 mg/L的2，4-D進(jìn)行雙因素和正交試驗(yàn)。

2.2 6-BA和NAA愈傷組織誘導(dǎo)的雙因素試驗(yàn)結(jié)果

6-BA和NAA組合愈傷組織誘導(dǎo)的雙因素試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 6-BA和NAA組合試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 6-BA and NAA combination test results

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黃芩莖段為材料，不同質(zhì)量濃度的6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）進(jìn)行雙因素試驗(yàn)，共9個(gè)處理（表3）。9個(gè)不同處理均能誘導(dǎo)產(chǎn)生黃芩愈傷組織，且顏色為淡綠色或黃綠色，結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)地較硬，但伴隨有不同程度分化現(xiàn)象（圖2）。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，黃芩愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較高；NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，黃芩愈傷組織分化程度較高，芽增殖系數(shù)大，NAA質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為81.11%。雖然9個(gè)處理均能誘導(dǎo)黃芩莖段形成愈傷組織，但都表現(xiàn)出不同程度的分化長(zhǎng)芽現(xiàn)象，不適合進(jìn)行繼代培養(yǎng)。因此，6-BA和NAA在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均不適合進(jìn)行黃芩愈傷組織誘導(dǎo)，但可用于黃芩無(wú)菌苗繼代過(guò)程中芽的增殖，培養(yǎng)基選擇為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA或MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA。

圖2 6-BA和NAA激素組合對(duì)黃芩莖段的誘導(dǎo)情況Fig.2 Induction of 6-BA and NAA hormone combination on the stem segments of Scutellaria baicalensis

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定外植體為莖段，同時(shí)以6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和2，4-D（0.05、0.15、0.25 mg/L）為條件，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，共9組，正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，9個(gè)處理均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，其中MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D的愈傷誘導(dǎo)率最高，為94.16%。由極差R分析可知，6-BA對(duì)黃芩莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響最大且差異顯著（P＜0.05，表5），2，4-D次之，NAA影響最小，后二者差異不顯著。由均值K值分析可知，6-BA的K值大小為K1＞K2＞K3，說(shuō)明隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，黃芩愈傷組織誘導(dǎo)率逐步降低，激素最佳作用質(zhì)量濃度為1.0 mg/L；NAA的K值大小為K2＞K1＞K3，說(shuō)明隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢(shì)，最佳作用質(zhì)量濃度為1.0 mg/L；2，4-D的K值大小為K2＞K3＞K1，說(shuō)明隨著2，4-D質(zhì)量濃度的增加，黃芩莖段愈傷組織的誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢(shì)，激素最佳作用質(zhì)量濃度為0.15 mg/L。故以莖段為外植體，理論最佳試驗(yàn)處理?xiàng)l件為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.15 mg/L 2，4-D，而在本試驗(yàn)中，實(shí)際得到的最佳試驗(yàn)組合為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D，激素2，4-D濃度稍有不同。此外，由圖3可知，除7、8號(hào)培養(yǎng)基（圖3-7、8）誘導(dǎo)的愈傷組織發(fā)生褐化、顏色呈黃棕色外，其他處理誘導(dǎo)的愈傷組織均生長(zhǎng)良好，且顏色呈淡黃色或黃綠色，結(jié)構(gòu)較疏松，無(wú)明顯分化現(xiàn)象，可用于繼代培養(yǎng)。

圖3 6-BA、NAA和2，4-D激素組合對(duì)黃芩莖段的誘導(dǎo)情況Fig.3 Induction of 6-BA，NAA and 2，4-D hormone combination on the stem segments of Scutellaria baicalensis

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.4 Orthogonal test analysis

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

3 結(jié)論與討論

自1958年第1例植物離體培養(yǎng)成功以來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)飛速發(fā)展，藥用植物組織培養(yǎng)也隨之發(fā)展。影響植物組織培養(yǎng)的因素有很多，包括培養(yǎng)基中大量元素（C、N、P和K源）和微量元素、外植體、植物激素和培養(yǎng)條件（溫度、光照和濕度等）等[15-16]。相關(guān)研究表明，6-BA的添加會(huì)提高多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的活性，而黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，其結(jié)構(gòu)上存在多個(gè)酚羥基，極易被POD氧化，從而導(dǎo)致愈傷組織發(fā)生褐化現(xiàn)象，影響其生長(zhǎng)[17-18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩愈傷組織隨著6-BA質(zhì)量濃度增加，其褐化現(xiàn)象會(huì)愈發(fā)嚴(yán)重，生長(zhǎng)停滯，與前人研究結(jié)果一致。生長(zhǎng)素類(lèi)激素，如IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）和NAA在植物組織培養(yǎng)中多用于誘導(dǎo)植物產(chǎn)生不定根[19]。本研究也得到類(lèi)似的結(jié)果，3種外植體在NAA作用下均可發(fā)生不同程度的生根現(xiàn)象，且外植體稍有膨大，原因可能是由于NAA刺激了愈傷相關(guān)基因的表達(dá)。在2，4-D誘導(dǎo)黃芩愈傷組織試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低濃度下愈傷組織呈乳白色，而高濃度下愈傷組織呈黃褐色，褐化嚴(yán)重，說(shuō)明低濃度2，4-D適合誘導(dǎo)愈傷組織，高濃度2，4-D則抑制生長(zhǎng)，這與武羿君等[20]的研究結(jié)果一致，高濃度下細(xì)胞分裂速度快，生長(zhǎng)不均衡，易褐化死亡。

在植物愈傷組織培養(yǎng)中，不同濃度和類(lèi)型的激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)情況均有差異。在本研究中，6-BA和NAA誘導(dǎo)的愈傷組織呈淡綠色，結(jié)構(gòu)致密，發(fā)生分化，這與孟書(shū)亦[13]、羅毓健[21]研究結(jié)果不同。本研究前期愈傷組織表現(xiàn)為整體膨大，呈淡綠色，無(wú)分化現(xiàn)象，而20 d之后，綠色芽點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)，產(chǎn)生分化，可能是由環(huán)境和內(nèi)外源激素共同影響所致。在正交試驗(yàn)中，黃芩愈傷組織呈淡黃色，生長(zhǎng)良好，增殖迅速，無(wú)分化現(xiàn)象。方差分析表明，2，4-D對(duì)誘導(dǎo)黃芩愈傷組織的產(chǎn)生無(wú)顯著影響，但結(jié)合雙因素結(jié)果可知，添加2，4-D能顯著提高黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)率，且極大降低分化程度，故認(rèn)為添加低質(zhì)量濃度的2，4-D對(duì)黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)作用明顯。2.0 mg/L 6-BA處理發(fā)生明顯褐化，推測(cè)應(yīng)當(dāng)是較高濃度6-BA和2，4-D共同作用從而提高多酚氧化酶活性，導(dǎo)致生長(zhǎng)不均衡，發(fā)生褐化現(xiàn)象。

關(guān)于黃芩愈傷組織褐化問(wèn)題，也是植物組織培養(yǎng)的普遍問(wèn)題，已有諸多研究。一方面可以調(diào)節(jié)外源激素的種類(lèi)和濃度，另一方面也可通過(guò)添加微量Vc（抗壞血酸）、CA（檸檬酸）、AC（活性炭）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和活性炭來(lái)減緩[22-23]，但不同抗褐變劑對(duì)不同植物材料作用效果有所差異。目前，黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)體系已初步建立，但激素之間的相互作用機(jī)制還尚未可知，科學(xué)界已對(duì)某些植物的誘導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了揭示，如擬南芥愈傷組織的中層細(xì)胞具有干細(xì)胞特征，其屬性由特征轉(zhuǎn)錄因子WOX5/7維 持，WOX5/7通過(guò)與PLT和ARR12蛋白結(jié)合調(diào)控內(nèi)源生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)控愈傷組織的進(jìn)一步分化和器官再生[24-25]。但關(guān)于黃芩愈傷組織是如何通過(guò)植物激素調(diào)控其狀態(tài)及分化還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)以黃芩根、莖段和葉片為材料進(jìn)行黃芩愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明，誘導(dǎo)黃芩愈傷組織的最適外植體依次為莖段＞根＞葉片，適合分化長(zhǎng)芽的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.25 mg/L 2，4-D。結(jié)果可為后續(xù)利用黃芩愈傷組織進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和活性成分的直接生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。