陳春路，成 穎，馬曉燕，黨文慶，賈凱琪，郭翔宇，呂麗華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于雌性動(dòng)物的生育能力有重要影響。羊一生可產(chǎn)生100萬(wàn)個(gè)卵泡，但只有不足5%的卵泡最終會(huì)發(fā)育成成熟卵泡，超過(guò)95%的卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖，所以降低卵泡閉鎖率對(duì)提高動(dòng)物生殖能力極為重要[1-5]。顆粒細(xì)胞（GCs）是卵泡中重要的體細(xì)胞，GCs與卵母細(xì)胞通過(guò)卵母細(xì)胞衍生因子之間建立聯(lián)系，顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞和卵泡的發(fā)育具有重要作用，進(jìn)而影響雌性動(dòng)物的生殖能力[6]。HE等[7]研究表明，顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和激素分泌與卵泡的正常發(fā)育與閉鎖密切相關(guān)。對(duì)于牛[8]、大鼠[9]、綿羊[10]的研究都證實(shí)，卵泡閉鎖的重要原因是顆粒細(xì)胞的凋亡。人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（Retinoblastoma，RB）是一個(gè)發(fā)現(xiàn)較早的抑癌基因,因其首先在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中被發(fā)現(xiàn)而命名。相關(guān)研究表明[11-13]，RB基因家族與肺癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等較多腫瘤的發(fā)生有關(guān)。RB蛋白是腫瘤抑制因子,在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及細(xì)胞分化、衰老和凋亡中起關(guān)鍵作用，但是其功能在絕大多數(shù)腫瘤中喪失[14]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2（Retinoblastoma-like protein-2，RBL2/p130）是RB家族中一個(gè)關(guān)鍵腫瘤抑制因子，可影響正常的細(xì)胞周期[15-18]，且具有抗凋亡的功能[18]。CHEN等[19]研究表明，下調(diào)LINC00899可通過(guò)RBL2影響FOXO通路，抑制脊髓室管膜瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。ZHU等[15]通 過(guò)miR-17-5p與RBL2的 靶 標(biāo) 關(guān) 系，提 高miR-17-5p的表達(dá)量來(lái)降低細(xì)胞中RBL2表達(dá)，從而影響正常的細(xì)胞周期，起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。SHI等[20]研究表明，在腎癌細(xì)胞中，TGF-β能夠誘導(dǎo)RBL2表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖。然而，RBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響還不清楚。

本研究通過(guò)在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRBL2，闡明干擾RBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成的影響，旨在為解析促進(jìn)卵泡發(fā)育機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在山西省太谷區(qū)某屠宰場(chǎng)采集150只大尾寒羊卵巢，將卵巢保存在4℃含1%雙抗的DPBS中，用75%酒精清洗2次，再用滅菌的DPBS將殘余酒精沖掉，用滅菌的眼科剪將卵泡剪下，待后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 主要試劑

DMEM/F12（武漢博士德生物工程有限公司），胎牛血清（賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司），Lipofiter3.0（漢恒生物科技有限公司），RNAiso Plus和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司）,雙抗（北京索萊寶科技有限公司），CCK8試劑盒（MedChem Express）,ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，江蘇），PerfectStart?Green qPCR SuperMix（北京全式金生物有限公司，北京），RBL2干擾RNA（siRBL2）片段以及siRNA NC（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，上海），合成的RNA序列如表1所示。

表1 siRBL2和NC序 列Tab.1 siRBL2 and NC sequences

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的收集與培養(yǎng) 選擇直徑為3～5 mm的卵泡，剪下后用75%的酒精消毒后置于DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，再用細(xì)胞刮及1 mL的無(wú)菌注射器將卵泡顆粒細(xì)胞刮出，于1 000 r/min離心5 min，棄上清后收集顆粒細(xì)胞，用無(wú)菌PBS重懸后離心，重復(fù)清洗3次。清洗后用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%雙抗+10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸混勻，并將懸液分裝于不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中。

1.3.2siRBL2的轉(zhuǎn)染 將卵泡顆粒細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70%時(shí)，用Lipofiter 3.0分別將siRNA NC和siRBL2轉(zhuǎn)染到綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中，6 h后，采用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行基因水平和類固醇類激素水平的檢測(cè)。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 采用NCBI中Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)RBL2、細(xì)胞增殖、凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成相關(guān)基因的引物，選擇β-actin為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 基因引物序列Tab.2 Gene primer sequences

續(xù)表2基因引物序列Tab.2（Continued）Gene primer sequences

1.3.4 qRT-PCR反應(yīng) 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄為cDNA的過(guò)程均按照TaKaRa公司的產(chǎn)品說(shuō)明書操作。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過(guò)程參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為10.0 μL：上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、5.0 μL的2×PerfectStart?Green qPCR SuperMix和4.6 μL Nuclease-Free Water。反應(yīng)程序按照說(shuō)明書上的3步法進(jìn)行。

1.3.5 CCK8檢測(cè) 采用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。將顆粒細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70%時(shí)，用Lipofiter 3.0將siRNA NC和siRBL2轉(zhuǎn) 染 顆 粒 細(xì) 胞，6 h后，將DMEM/F12換成完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)0、12、24、36、48 h后，更換完全培養(yǎng)基，每孔加入10.0 μL的CCK8，37℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值，計(jì)算轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段的細(xì)胞存活率。

1.3.6 ELISA細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染siRBL2后48 h收上清。加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育30 min，洗板5次后加入酶標(biāo)試劑，37℃孵育30 min，洗板5次后，37℃顯色10 min，終止反應(yīng)，15 min之內(nèi)讀取樣品OD值。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中E2和P4實(shí)際濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量（取3次計(jì)算的平均值）。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在SPSS 22.0中運(yùn)用t檢驗(yàn)和單因素（ANOVA）方差分析差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 siRBL2轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

合成的siRBL2的轉(zhuǎn)染效率如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，siRBL2的表達(dá)量顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明干擾效果較好。

圖1 siRBL2轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)結(jié)果Fig.1 siRBL2 transfection efficiency test results

2.2 siRBL2對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因的影響

干擾RBL2后檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 siRBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of siRBL2 on cycle-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

從 圖2可 以 看 出，F(xiàn)OXO3a和CCND1的 表 達(dá)量顯著升高（P＜0.05），P21和P27這2個(gè)基因的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。表明干擾RBL2可能對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

2.3 干擾RBL2對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響

干擾RBL2檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，結(jié)果如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，BCL-2的表達(dá)量差異不顯著，但有升高的趨勢(shì)；BAX、BAD和Caspase3基因的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），BCL-2/BAX的值極顯著上升（P＜0.05）。說(shuō)明干擾RBL2可能抑制細(xì)胞凋亡。

圖3 siRBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of siRBL2 on apoptosis-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.4 干擾RBL2對(duì)抗氧化相關(guān)基因的影響

轉(zhuǎn)染siRBL2后檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果表明（圖4），CAT和SOD2基因的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），提示siRBL2可能有助于提高綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的抗氧化能力。

圖4 siRBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of siRBL2 on antioxidation-related gene expression in sheep follicular granulosa cells

2.5 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

用siRNA NC和siRBL2轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，分別在0、12、24、36、48 h用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示（圖5），轉(zhuǎn)染后12 h，siRBL2對(duì)細(xì)胞活力影響不顯著，轉(zhuǎn)染24、36、72 h后差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明siRBL2可能促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。

圖5 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.5 Cell proliferation detected by CCK8

2.6 siRBL2對(duì)類固醇類激素合成的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集上清，檢測(cè)E2和P4水平，結(jié)果表明（圖6、7），E2水平顯著上升（P＜0.05），P4水平顯著下降（P＜0.05）。同時(shí)采用qRT-PCR檢測(cè)類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖8），3β-HSD和STAR基因的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），CYP11A1的表達(dá)量差異不顯著，但有下降趨勢(shì)；CYP19A1的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。說(shuō)明干擾RBL2能夠提高E2水平，降低P4水平。

圖6 siRBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素（E2）水平的影響Fig.6 Effects of siRBL2 on the level of estrogen（E2）in sheep follicular granulosa cells

圖8 siRBL2對(duì)類固醇類激素合成相關(guān)基因的影響Fig.8 Effects of siRBL2 on genes related to steroid hormone synthesis

圖7 siRBL2對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中孕激素（P4）水平的影響Fig.7 Effects of siRBL2 on the level of progesterone（P4）in sheep follicular granulosa cells

3 結(jié)論與討論

卵泡的發(fā)育狀態(tài)對(duì)雌性動(dòng)物的生殖能力具有重要影響且受多種因素調(diào)控。雌性動(dòng)物的大部分卵泡會(huì)發(fā)生閉鎖，只有少數(shù)卵泡可發(fā)育至正常排卵，而顆粒細(xì)胞是卵泡中具有重要功能的體細(xì)胞。顆粒細(xì)胞通過(guò)間隙連接為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)并進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，特別是雌激素和黃體酮等類固醇激素，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用[21]，所以顆粒細(xì)胞的凋亡對(duì)卵泡閉鎖具有重要影響。卵巢中類固醇類激素主要在顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中產(chǎn)生[22]。在卵巢中，卵泡外部的膜細(xì)胞能夠分泌雄激素，雄激素被顆粒細(xì)胞芳香化為雌二醇，在此轉(zhuǎn)化過(guò)程中作為編碼雌激素合成酶的CYP19A1基因起到至關(guān)重要的作用[23]。研究表明，雌激素能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，抑制顆粒細(xì)胞的凋亡[24]。在山羊中，雌激素的產(chǎn)生能夠提高山羊卵泡顆粒細(xì)胞的活性[25]。干擾RBL2后雌激素水平明顯上升，同時(shí)CYP19A1基因的表達(dá)量上升，表明干擾RBL2能夠促進(jìn)雌激素的合成，進(jìn)而對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。卵泡發(fā)育后期，促黃體素會(huì)導(dǎo)致雌激素水平下降、顆粒黃體細(xì)胞分泌的孕激素水平升高，STAR、CYP11A1、3β-HSD基因的表達(dá)水平較高[26]。高濃度的孕激素能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[27]和卵巢癌細(xì)胞[28]的凋亡，抑制細(xì)胞增殖。孕激素可能通過(guò)FOXO通路對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響。與對(duì)照組相比，干擾RBL2后孕激素的水平顯著下降，3β-HSD和STAR基因表達(dá)量顯著下降，CYP11A1基因的表達(dá)量差異不顯著，但有下降的趨勢(shì)。因此，低濃度的孕激素可能對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

RBL2/p130蛋白屬于RB蛋白家族成員，該家族成員還包括RB1/p105和RBL1/p107蛋白，它們都能夠影響細(xì)胞周期，并且可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是RBL2/p130磷酸化的主要激酶，同時(shí)RBL2/p130能夠與E2F4相結(jié)合形成異二聚體，對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[29-30]。FOXO3a是FOXO家族中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，不同動(dòng)物卵泡發(fā)育過(guò)程中均有FOXO家族基因的表達(dá)。FOXO信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。降低FOXO3a的表達(dá)量能夠促進(jìn)鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖[31]，F(xiàn)OXO3a也可參與 豬[32]、大 鼠[33]、耗 牛[34]、雞[35]卵 泡 顆 粒 細(xì) 胞 的 生 長(zhǎng)發(fā)育。CHEN等[19]研究表明，下調(diào)RBL2能夠激活FOXO通路，促使FOXO表達(dá)量明顯上升，而下游的P21和P27基因的表達(dá)量顯著降低，可影響細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞增殖。CCND1是細(xì)胞增殖的標(biāo)志性 基 因[36]。LU等[37]和WANG等[38]研 究 表 明，miR-17-92簇可能通過(guò)靶向RBL2影響小鼠胚胎肺上皮細(xì)胞的增生和脂肪細(xì)胞的分化。干擾RBL2后，F(xiàn)OXO3a和CCND1基因的表達(dá)量顯著上升，細(xì)胞周期相關(guān)基因P21和P27基因的表達(dá)量顯著下降。因此，干擾RBL2可能對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

BCL-2家 族 中有抗凋亡因子BCL-2、BAX和BAD。相關(guān)研究表明，BCL-2/BAX的值對(duì)細(xì)胞凋 亡 非 常 重 要[39-41]。GUO等[42]和LI等[43]研 究 表 明，BCL-2/BAX的值升高時(shí)，對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用；反之，對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。干擾RBL2后，BCL-2基因的相對(duì)表達(dá)量升高，BAX和BAD基因的相對(duì)表達(dá)量降低，而B(niǎo)CL-2/BAX的值顯著上升。同時(shí)，Caspase基因家族也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在干擾RBL2后，Caspase3的表達(dá)量顯著下降。上述研究表明，干擾RBL2可能對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡有抑制作用。

活性氧（ROS）對(duì)維持細(xì)胞正常內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生大量ROS，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重影響。而過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶2（SOD2）作為抗氧化酶能夠參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，修復(fù)細(xì)胞中氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷。大量研究表明，在大鼠[44]、小鼠[45]、綿羊[46]的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，通過(guò)不同途徑調(diào)控氧化應(yīng)激均有可能影響細(xì)胞周期，對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)干擾RBL2后檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因CAT和SOD2，結(jié)果顯示，CAT和SOD2的表達(dá)量顯著上升。MC-LR能夠誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激，對(duì)卵泡的正常發(fā)育產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響雌性動(dòng)物的生殖能力[47]。因此，干擾RBL2可能提高抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。

綜上所述，干擾RBL2可能在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、抗氧化及類固醇類激素合成中對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生影響，進(jìn)而促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。