佟盟露，丁玉玲，賈孫悅，馬騰飛，周 芹，3，4*，姜宜飛

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，黑龍江 哈爾濱 150080；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

引言

毒氟磷是一種新型α-氨基膦酸酯類殺菌劑，化學(xué)名稱為N-[2-(4-甲基苯并噻唑基)]-2-氨基-2-氟代苯基-O，O-二乙基膦酸酯[1]，是一種新型高效的抗病毒制劑，能夠激活植物的系統(tǒng)性抗性(SAR)[2]。植物病毒是第二大類植物病害[3]，變異速度快，不斷出現(xiàn)新毒株[4]，具有危害大，難檢測(cè)以及難防治等特點(diǎn)[5]，因此，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極其嚴(yán)重的危害，為了防止植物病毒病的大規(guī)模爆發(fā)，貴州大學(xué)歷經(jīng)十年的研究，發(fā)現(xiàn)了具有全新結(jié)構(gòu)的磷系抗植物病毒新農(nóng)藥-毒氟磷，并獲得農(nóng)業(yè)部新農(nóng)藥登記，成為具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的農(nóng)藥品種[6]。

毒氟磷具有主動(dòng)防御，促進(jìn)生長(zhǎng)以及內(nèi)吸作用等基本特性[7]，還可以調(diào)節(jié)植物的內(nèi)源生長(zhǎng)因子，恢復(fù)植物葉部功能及根部生長(zhǎng)。對(duì)植物病毒也有很高的防治效果[8]，其中對(duì)黃瓜、煙草以及番茄病毒都有防治作用[9]，此外，毒氟磷對(duì)水稻黑條矮縮病等的防治效果也非常顯著，Li等[10]經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，毒氟磷在體內(nèi)和田間試驗(yàn)中都能抑制水稻黑條矮縮病毒在水稻中的感染活性，與SRBSDV P9-1基因表達(dá)的抑制活性最高，且在體外與SRBSDV P9-1蛋白有微弱的親和力，最終證實(shí)毒氟磷與P9-1八聚體蛋白內(nèi)孔中的精氨酸175結(jié)合而抑制SRBSDV的感染，具有良好的應(yīng)用前景。

如今，農(nóng)藥的安全性問題被越來越多的人關(guān)注。毒氟磷作為一種新型的環(huán)保型抗病毒有機(jī)磷農(nóng)藥，被廣泛普及應(yīng)用，但對(duì)毒氟磷的體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)非常有限[11]，且由于毒氟磷的高對(duì)映選擇性和高控制成本，導(dǎo)致毒氟磷的非手性分析以及殘留物測(cè)定仍沒得到充分的發(fā)展。鄭坤明等[12]采用高效液相色譜測(cè)定了大棚和露地條件下，西瓜中毒氟磷的殘留量在0.01～5.0mg/kg添加水平下，毒氟磷平均回收率分別為84.5%～103.9%，RSD為1.2%～7.5%，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。焦斌等[13]建立了土壤中毒氟磷殘留的檢測(cè)方法，采用QuEChERS前處理，應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行樣品檢測(cè)，在準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度上均滿足殘留分析要求，可以為毒氟磷在中國(guó)典型土壤中的殘留檢測(cè)提供方法支撐。目前的研究報(bào)道多數(shù)是關(guān)于毒氟磷在植株，土壤及水體中的殘留問題，毒氟磷制劑有效成分檢測(cè)方面的報(bào)道比較少，不少企業(yè)為了降低農(nóng)藥成本，提高農(nóng)藥防治效果，在產(chǎn)品中添加非法成分[14]，隱性添加不易察覺，尚未建立系統(tǒng)的農(nóng)藥成分監(jiān)管方法[15]，陳書華等[16]在市場(chǎng)抽檢的生物農(nóng)藥樣品中，禁限用農(nóng)藥成分檢出率高達(dá)42.9%，農(nóng)藥添加未經(jīng)登記的農(nóng)藥成分已經(jīng)影響了農(nóng)藥質(zhì)量安全。因此，對(duì)農(nóng)藥制劑有效成分的檢測(cè)非常必要，本實(shí)驗(yàn)擬建立一種方法可以同時(shí)適用于毒氟磷原藥(technical material簡(jiǎn)寫為TC)及可濕性粉劑(water power簡(jiǎn)寫為WP)中有效成分的測(cè)定。采用反相高效液相色譜法，通過波長(zhǎng)掃描確定最適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，特異性檢驗(yàn)確定峰純度，優(yōu)化了流動(dòng)相比例，建立的方法完全滿足上述要求，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測(cè)器)；色譜柱為250 mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝 ZORBAX SB-C18、粒徑為5μm；針式過濾器(配有孔徑為0.45μm的濾膜)；50μL微量進(jìn)樣器；5μL定量進(jìn)樣管；超聲波清洗器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 色譜純甲醇；新蒸二次蒸餾水或超純水；已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%的毒氟磷標(biāo)樣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件 流動(dòng)相：Ψ(甲醇：水)=80：20，經(jīng)濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃±2 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣體積：5μL。

1.2.2 測(cè)定步驟

醫(yī)院門診大廳有一塊區(qū)域是門診服務(wù)中心，有大量自助服務(wù)設(shè)備，提供建檔、預(yù)約、掛號(hào)、查詢、充值等自助服務(wù)，涵蓋患者就診全流程。這只是醫(yī)院自助機(jī)總量的一部分，鈕羅涌介紹，全院不同角落分布著150多臺(tái)自助服務(wù)機(jī)。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 將0.05g(需要精確到0.000 1g)毒氟磷標(biāo)樣，放入體積為100mL的容量瓶中，加入一定體積的甲醇，使用超聲波清洗器進(jìn)行超聲，超聲的時(shí)間是5～10min，將其冷卻到室溫，最終用甲醇稀釋定容至刻度線，搖勻備用。

1.2.2.2 試樣溶液的制備 將含有0.05g(需要精確到0.000 1g)毒氟磷的試樣，放入體積為100mL的容量瓶中，加入一定體積的甲醇，使用超聲波清洗器進(jìn)行超聲，超聲的時(shí)間是5～10 min，將其冷卻到室溫，最終用甲醇稀釋定容到刻度線，搖晃均勻，過濾備用。

1.2.2.3 測(cè)定 在這個(gè)操作條件之下，等到儀器穩(wěn)定之后，將多針標(biāo)樣溶液連續(xù)注入進(jìn)去，直到毒氟磷相鄰2針的峰面積之間的相對(duì)變化<1.2%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 毒氟磷結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，在紫外區(qū)會(huì)有吸收，為了確定毒氟磷最適宜的吸收波長(zhǎng)，利用高效液相色譜配制的二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)毒氟磷溶液進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍是190～400nm(圖1是毒氟磷的紫外光譜圖)，圖中可見，毒氟磷在227nm處有最大的吸收波長(zhǎng)，在270nm處也有較強(qiáng)吸收，用這2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)對(duì)毒氟磷進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，雖然在227nm處?kù)`敏度更高，但是基線的平衡時(shí)間過長(zhǎng)，而且在227nm處一些雜質(zhì)會(huì)有紫外吸收，因此，為了檢測(cè)減少其他雜質(zhì)對(duì)毒氟磷的干擾，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm[17]。

圖1 毒氟磷的紫外光譜圖

2.1.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇 通常而言，流動(dòng)相的比例配制以及流速的設(shè)置都對(duì)復(fù)雜樣品的分離有著很大的影響，因此，實(shí)驗(yàn)前必須要優(yōu)化流動(dòng)相配比，本實(shí)驗(yàn)選擇的色譜柱是反相色譜柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18。根據(jù)毒氟磷物理和化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)，用甲醇來溶解樣品，流動(dòng)相用甲醇和水，對(duì)不同比例的甲醇/水體系進(jìn)行比較，選擇最適的流動(dòng)相比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的增加，保留時(shí)間逐漸減小，出峰時(shí)間過早，會(huì)有一些雜質(zhì)干擾；而如果水含量過高，保留時(shí)間過長(zhǎng)，峰形較寬，拖尾，而且靈敏度也會(huì)隨之降低，因此，最終選擇的流動(dòng)相是Ψ(甲醇：水)=80 ：20，以1.0mL/min為流速。在這個(gè)條件下，能夠呈現(xiàn)出較好的峰形，而且能夠徹底與其他物質(zhì)分開，精密度和準(zhǔn)確度良好，并且在10min之內(nèi)就可以達(dá)到基線分離，分析時(shí)間較短，提高了工作效率。在優(yōu)化的流動(dòng)相比例及檢測(cè)波長(zhǎng)條件下，毒氟磷出峰時(shí)間大約在8.1min(圖2～圖4毒氟磷標(biāo)準(zhǔn)品、原藥及可濕性粉劑的液相色譜圖)。

2.2 峰純度檢驗(yàn) 一個(gè)分析方法建立后，需要對(duì)其專屬性進(jìn)行驗(yàn)證[18]，峰純度(Peak purity)檢查越來越多的被用于評(píng)價(jià)方法專屬性，可以提供峰純度的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、質(zhì)譜(MS)及多通道紫外可見光檢測(cè)器等等。峰純度成為是否能夠準(zhǔn)確分析的重要因素[19]。本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法對(duì)毒氟磷進(jìn)行鑒別，30%毒氟磷可濕性粉劑以及98%毒氟磷原藥中的毒氟磷的峰純度因子全部都>990，有效成分處沒有被其他雜質(zhì)所干擾，符合標(biāo)準(zhǔn)(圖5～圖6)。

保留時(shí)間/min圖2 毒氟磷標(biāo)準(zhǔn)品的的液相色譜圖

保留時(shí)間/min圖3 毒氟磷原藥液相色譜圖

保留時(shí)間/min圖4 毒氟磷可濕性粉劑液相色譜圖

圖5 98%毒氟磷原藥HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖6 30%毒氟磷可濕性粉劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

圖7 毒氟磷峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2.3.2方法精密度試驗(yàn) 精密度為同一標(biāo)準(zhǔn)樣品多次測(cè)定的變異系數(shù)[20]，通常用偏差，標(biāo)準(zhǔn)偏差以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一樣品進(jìn)行5次測(cè)定，計(jì)算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。按照1.2.2試樣溶液的制備方法，分別配制5個(gè)98%毒氟磷原藥精密度溶液，標(biāo)記為TC-A1至TC-A5。5個(gè)30%毒氟磷可濕性粉劑精密度溶液，從WP-A1到WP-A5依次進(jìn)行標(biāo)記。將STD3作為標(biāo)液，按照以上的操作條件，待儀器基線穩(wěn)定后，在標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序下，依次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(表1、表2)。

表1 98%毒氟磷原藥中毒氟磷精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷精密度試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，98%毒氟磷原藥中毒氟磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為1.23%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.35(C=0.934 0)，30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的RSD為1.61%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.62，(其中C=0.282 2)，測(cè)定出的精密度符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取含0.025g(精確至0.000 1g)毒氟磷的30%毒氟磷可濕性粉劑于放入體積為100mL容量瓶中，再加入0.025g(精確至0.000 1g)的毒氟磷標(biāo)樣，同1.2.2的方法對(duì)溶液進(jìn)行配置，選擇5個(gè)有效成分準(zhǔn)確度溶液，從WP-B1到WP-B5依次進(jìn)行標(biāo)記。將線性相關(guān)溶液STD3作為標(biāo)樣溶液，待儀器基線穩(wěn)定后，在標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序下，依次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30%毒氟磷可濕性粉劑中毒氟磷平均回收率為99.43%，具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 30%毒氟磷可濕性粉劑回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 不同實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證 為了驗(yàn)證所建立的能夠同時(shí)適用于98%毒氟磷原藥和30%毒氟磷可濕性粉劑中有效成分檢測(cè)方法能夠適用于每一個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室，因此按照已經(jīng)建立好的方法，對(duì)4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)。每組4家單位在2個(gè)不同日期對(duì)樣品含量進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，分別計(jì)算試樣1和試樣2的結(jié)果，每個(gè)樣品2個(gè)不同日期測(cè)定得到4個(gè)結(jié)果，(表4、表5)。

表4 98%毒氟磷原藥協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表5 30%毒氟磷可濕性粉劑協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr分別為0.562 7%、0.557 3%，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR分別為0.733 9%、0.816 2%，都小于相應(yīng)的Horwitz公式2(1-0.51ogC)理論計(jì)算值，表明不同單位間的檢測(cè)結(jié)果符合性良好，所建立的毒氟磷液相色譜分析方法能夠解決日常檢測(cè)工作的需求，結(jié)果(表6)。

表6 不同實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

高效液相色譜擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，方便快捷，具有較高的準(zhǔn)確性，可以檢測(cè)到微量成分，因此被廣泛使用，然而目前的研究結(jié)果主要集中于毒氟磷殘留的檢測(cè)方面，而對(duì)于農(nóng)藥制劑有效成分等方面的研究?jī)?nèi)容相對(duì)較少，且多數(shù)研究結(jié)果都只建立了測(cè)定一種試劑有效成分的高效液相色譜分析方法，如葛家成等[21]建立了一種測(cè)定氟氯蟲雙酰胺懸浮劑有效成分的高效液相色譜分析方法，王睿等[22]建立一種對(duì)40%環(huán)丙唑醇懸浮劑進(jìn)行分離和測(cè)定的高效液相色譜分析方法，而本研究能夠同時(shí)測(cè)定98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑中有效成分含量的高效液相色譜分析方法。

本試驗(yàn)還按照已經(jīng)建立好的方法，對(duì)4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)，數(shù)據(jù)表明，不同單位間的檢測(cè)結(jié)果符合性良好，充分滿足日常檢測(cè)工作的需要。

4 結(jié)論

本研究建立的毒氟磷測(cè)定方法，98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.23%和1.61%；30%毒氟磷可濕性粉劑的回收率為99.43%，不同實(shí)驗(yàn)室不同儀器之間的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)分別為0.562 7%和0.557 3%，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)分別為0.733 9%、0.816 2%。該方法能夠獲得較高的精密度和準(zhǔn)確度，且線性關(guān)系良好，能夠滿足毒氟磷含量分析的要求，操作簡(jiǎn)單，快捷，為98%毒氟磷原藥、30%毒氟磷可濕性粉劑質(zhì)量控制提供了一種可行的方法。