呂煥煥，宋 朋，高勝健，張燕青，趙廣義，段麗芳

(1.山東威瑞信試驗(yàn)檢測有限公司，山東 濟(jì)南 250119；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

1 前言

香芹酚英文名稱：carvacrol，CAS號：499-75-2，分子式：C10H14O，化學(xué)名稱：2-甲基-5-異丙基苯酚；香荊芥酚；5-異丙基-2-甲基苯酚。香芹酚是一種純天然的植物源化合物，天然存在于牛至、百里香、冬季香薄荷等唇形科植物的精油中，對真菌、細(xì)菌具有廣譜抗菌活性。香芹酚被開發(fā)和應(yīng)用到農(nóng)業(yè)病害防治領(lǐng)域，它具有抗真菌作用，作用靶點(diǎn)多，對作物病害防治不易產(chǎn)生抗性、藥害的優(yōu)點(diǎn)，還能起到刺激農(nóng)作物生長、增強(qiáng)免疫力、提高產(chǎn)量的效果，是有機(jī)綠色農(nóng)藥產(chǎn)品的代表之一。

目前國內(nèi)有關(guān)香芹酚水劑的分析方法未見公開報道。本文采用高效液相色譜法對0.5%香芹酚水劑進(jìn)行定量分析，該方法操作簡便快捷，分離效果好，精密度和準(zhǔn)確度均能達(dá)到定量分析的要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 乙腈(色譜純)；超純水(電阻率18.2MΩ·cm，25℃)；磷酸(分析純) ；磷酸溶液：ψ(磷酸：水)=1：1 000；香芹酚標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%；0.5%香芹酚水劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：日立Primaide，具有二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器；日立色譜工作站；色譜柱：250mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色譜操作條件 流動相：Ψ(乙腈：磷酸溶液)=55+45(V/V)；流量：1.0mL/min；柱溫：30±2℃；檢測波長：275nm；進(jìn)樣體積：20μL；保留時間：香芹酚約9.0min。典型的香芹酚標(biāo)樣和0.5%香芹酚水劑的高效液相色譜圖(圖1、圖2)。

圖1 香芹酚標(biāo)樣高效液相色譜圖

圖2 0.5%香芹酚水劑高效液相色譜圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱取0.05g香芹酚標(biāo)樣(精確至0.000 1g)，置于50mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超聲波振，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。用移液管移取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中香芹酚0.05g的試樣(精確至0.000 1g)，置于50mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。用移液管移取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液的響應(yīng)值相對變化<1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中香芹酚峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中香芹酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按式(1)計算：

(1)

式中：

A1──標(biāo)樣溶液中香芹酚峰面積的平均值；

A2──試樣溶液中香芹酚峰面積的平均值；

m1──標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2──試樣的質(zhì)量，g；

P──標(biāo)樣中香芹酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇 通過日立Primaide高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，獲得香芹酚的紫外波長掃描圖(圖3)。從圖中可以看到香芹酚最大吸收波長在220nm處，在275nm處也有較大的吸收，為了盡量減少溶劑的干擾，將檢測波長定為275nm。

圖3 香芹酚的紫外光譜圖

色譜柱選擇250mm×4.6mm(i.d.)ZORBAX SB-C18、5um的不銹鋼柱。根據(jù)香芹酚物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長，選擇乙腈作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動相，為了得到更好的分離效果和峰形，在1 000mL水里加入1mL磷酸。將流動相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著乙腈比例的增加，保留時間減小，當(dāng)乙腈與水比例達(dá)到60 ：40時，有雜質(zhì)峰干擾香芹酚，峰純度達(dá)不到試驗(yàn)要求，最終選擇Ψ(乙腈：0.1%磷酸水溶液)=55：45作為流動相，流速1.0mL/min。該條件下，香芹酚色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時間較短，提高了工作效率。

3.2 分析方法的特異性試驗(yàn) 將2.4.1、2.4.2配制的香芹酚標(biāo)樣溶液和試樣溶液，在上述色譜操作條件下進(jìn)行全波段掃描、峰純度分析。結(jié)果表明標(biāo)樣溶液和試樣溶液中香芹酚峰純度均>990，有效成分出峰處無其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

3.3 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 稱取0.05g香芹酚標(biāo)樣(精確至0.000 1g)，置于50mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。用移液管移取3、4、5、6、7mL上述溶液，分別置于50mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，配置成5個不同濃度的標(biāo)樣溶液。在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，以香芹酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，得到香芹酚線性回歸方程為y=60 026x+40 160，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

圖4 香芹酚線性關(guān)系圖

3.4 分析方法的精密度試驗(yàn) 從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱取5個試樣，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測得香芹酚的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002 8，變異系數(shù)為0.569%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的香芹酚水劑(0.492%)中稱取5個試樣，分別加入一定量的香芹酚標(biāo)樣(99.0%)，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測得香芹酚的平均回收率為100.25%(表2)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本文建立了香芹酚水劑有效成分含量測定的高效液相色譜分析方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法分離效果好、線性關(guān)系良好，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，分析操作簡便快捷，是香芹酚水劑產(chǎn)品質(zhì)量控制較為理想的分析方法。