李 陽，張靜喆，顧宏剛*

（1.鄭州人民醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州 450003；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院普外科，上海 200032）

過氧化氫（H2O2）具有很強的氧化性，不僅可以直接氧化細胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，還可以通過細胞膜與細胞內(nèi)的鐵離子發(fā)生反應(yīng)，生成活性更強的自由基（如OH等），引起一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。選用H2O2誘導(dǎo)正常人肝細胞LO2氧化應(yīng)激模型，研究升清膠囊六種單體對正常人肝細胞LO2氧化應(yīng)激模型的修復(fù)作用，進一步闡明升清膠囊抗氧化能力，篩選其有效單體成分，并分析其安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人肝細胞LO2（normal human hepatic cell line） 由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心提供。

1.1.2 藥物與試劑 98%純度白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E（南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；30% H2O2（上海阿拉丁公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；青霉素、硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；噻唑藍（MTT）（上海譜振生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司）。

1.1.3 藥物配置 將升清膠囊（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院院內(nèi)制劑，滬藥制字Z05170981，由生大黃、虎杖、陳皮三味中藥組成）的六種單體（白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸）和維生素E分別用DMSO溶解，若不能充分溶解，則借助超聲波溶解。為了減少對試驗的影響，DMSO在含藥培養(yǎng)液中的最終體積比最好低于0.1%。

1.1.4 實驗儀器 超凈工作臺（江蘇蘇凈集團安泰公司）；DHG-9203A 型電熱恒溫干燥箱（上海精密實驗設(shè)備有限公司）；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；電子分析天平、架盤藥物天平、精密PH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ThermoMK3酶標儀、細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；可調(diào)式移液器（德國Eppendorf公司）；Olympus IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；J-301高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；純水凈化儀（美國MiliQ公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲有限公司）；液氮生物容器（成都金鳳液氮容器有限公司）；恒溫水浴箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；-20℃冰箱（美國ScienTemp公司）；-80℃冰箱（日本三洋公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

正常人肝細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI 1 640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)生長狀況進行傳代培養(yǎng)，待細胞生長至約80%融合狀態(tài)可用于實驗。

1.3 實驗方法

MTT還原測定法檢測細胞活性MTT還原測定法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。噻唑藍（MTT）是一種可接受氫離子的黃色化合物，作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在細胞色素C和琥珀酸脫氫酶的作用下四唑（tetrazolium）環(huán)開裂，還原生成水不溶性藍紫色的甲臜（formazan）結(jié)晶，并沉積在細胞中，死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原，因此甲臜結(jié)晶的生成量與活細胞數(shù)目成正比。用DMSO溶解還原生成的甲臜結(jié)晶，在490 nm波長處，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定光吸收（OD）值，來反映出活細胞數(shù)目。MTT法不能測定細胞絕對數(shù)，只能用來檢測細胞相對活力和相對數(shù)。為確保實驗結(jié)果的線性，采用酶標儀檢測結(jié)果時，MTT 吸光度的范圍最好在0～0.7。

1.4 分組及干預(yù)

1.4.1 檢測H2O2對肝細胞半數(shù)抑制濃度（IC50） 取對數(shù)生長期肝細胞，分為正常組和模型組，模型組按 H2O2不同濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、400 μm、600 μm、800 μm、1 000 μm）再分為 8 組，每組設(shè)6個平行孔。調(diào)整細胞懸液濃度，按每毫升1×105細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。置于5%CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，模型組加入200 μL含有不同終濃度H2O2的培養(yǎng)液，正常組加入等體積培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μL RPMI-1 640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μL含10% MTT的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入100 μLDMSO，置搖床上振蕩10 min，充分溶解甲臜，用酶標儀測定490 nm處的光密度（OD）值，計算細胞的生長抑制率。

1.4.2 升清膠囊六種單體及VE對肝細胞的生長抑制情況的影響 取對數(shù)生長期肝細胞，分為正常組和實驗組（白藜蘆醇苷組、白藜蘆醇組、橙皮苷組、大黃酚組、大黃素組、大黃酸組、維生素E組），每個實驗組按不同藥物濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、300 μm、400 μm）再行分組，共 43組，每組設(shè)6個平行孔。按每毫升1×105細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，實驗組每組每孔加入200 μL含有不同濃度的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E的RPMI-1 640培養(yǎng)液，正常組加入等體積的RPMI-1 640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。MTT法測定細胞活性。

1.4.3 升清膠囊六種單體對肝細胞氧化應(yīng)激的影響 取對數(shù)生長期肝細胞，分為正常組、模型組、白藜蘆醇苷治療組、白藜蘆醇治療組、橙皮苷治療組、大黃酚治療組、大黃素治療組、大黃酸治療組和維生素E對照組，治療組和對照組按藥物不同濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm）再行分組，共 30 組，每組設(shè)6個平行孔。按每毫升1×105細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，模型組、治療組、對照組分別加入200 μL由培養(yǎng)液稀釋成終濃度為300 μm的H2O2，正常組加入等體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，治療組、對照組每組每孔加入200 μL含有不同濃度的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E的RPMI-1 640培養(yǎng)液，正常組和模型組加入等體積的RPMI-1 640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。MTT法測定細胞活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗方法，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0進行統(tǒng)計，用levene法進行方差齊性檢驗，行單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較，方差齊用LSD-t法，方差不齊用Tamhane’s T2法，進行顯著性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；以P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞氧化應(yīng)激模型的建立

肝細胞經(jīng)H2O2作用后，求得IC50值作為建立模型的濃度。結(jié)果見表1、圖1。

表1 不同H2O2濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s，n= 70）

表1 不同H2O2濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s，n= 70）

注：與正常組比較，## P＜0.01

組別 濃度/μm 細胞生存率/%正常組 0 100.00±1.88模型組 1 25 94.86±2.12模型組 2 50 89.64±2.45##模型組 3 100 80.09±2.19##模型組4 200 59.20±2.38##模型組 5 400 39.85±2.19##模型組 6 600 24.84±2.07##模型組 7 800 16.64±2.07##模型組 8 1000 5.41±1.08##

圖1 不同H2O2濃度對肝細胞存活率的影響

由表1和圖1可以求得H2O2的半數(shù)抑制濃度為300 μm，此時細胞雖遭受一定程度的損傷，但仍具有活力。因此，后續(xù)實驗采用H2O2的作用濃度為300 μm、作用時間為1 h的模型條件下展開。

2.2 升清膠囊有效成分及VE的安全性分析

肝細胞經(jīng)過不同濃度的升清膠囊六種單體及維生素E作用24 h后細胞存活情況如表2、圖2所示。

圖2 不同藥物濃度對肝細胞存活率的影響

表2 不同藥物濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

表2 不同藥物濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

組別 例數(shù) 25 50 100 200 300 400白藜蘆醇苷組 36 89.56±2.29 85.15±3.01 79.08±3.87 49.96±3.34 41.43±2.98 27.87±2.06白藜蘆醇組 36 96.23±2.19 93.25±3.03 86.47±3.43 72.45±2.87 50.54±2.65 29.13±2.67橙皮苷組 36 95.68±1.94 88.42±2.91 85.56±3.28 83.03±3.62 75.15±3.89 48.36±2.83大黃酚組 36 96.75±2.57 91.26±3.32 80.39±3.86 69.65±3.48 48.53±3.09 28.94±2.61大黃素組 36 95.13±2.91 90.28±3.54 83.61±3.78 60.24±3.05 40.03±2.87 19.85±2.69大黃酸組 36 94.81±2.47 84.81±3.06 59.57±3.79 43.82±3.32 33.64±2.95 17.59±1.83維生素 E 組 36 95.48±1.62 93.12±2.33 87.29±3.06 53.34±3.94 38.36±3.21 23.58±1.88正常組 6 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34

由表2和圖2可以求得升清膠囊六種單體：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸及對照品維生素E對肝細胞的IC50分別為200 μm、300 μm、390 μm、290 μm、245 μm、155 μm、220 μm。升清膠囊六種單體的IC50均＞150 μm，表明這六種單體對肝細胞的毒性小，安全性高；并且維生素E的IC50也＞200 μm。后續(xù)實驗采用的藥物濃度均在IC50范圍內(nèi)，以保證藥物對細胞的毒性降至最低。

2.3 升清膠囊有效成分的篩選

肝細胞經(jīng)300 μm H2O2作用1 h，采用不同濃度的升清膠囊六種單體及維生素E對H2O2氧化應(yīng)激模型修復(fù)24 h后，細胞存活情況見表3、圖3。

表3 不同藥物在不同濃度下對H2O2作用的肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

表3 不同藥物在不同濃度下對H2O2作用的肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

注：與白藜蘆醇治療組（50 μm）內(nèi)比較，## P＜0.01；與橙皮苷治療組（100 μm）內(nèi)比較，△△ P＜0.01；與大黃酚治療組（50 μm）內(nèi)比較，▲▲P＜0.01；與維生素E對照組（50 μm）內(nèi)比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與大黃酚治療組（50 μm），■P＜0.05，■■P＜0.01；與橙皮苷治療組（100 μm）比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組別 例數(shù) 25 50 100 200白藜蘆醇苷治療組 24 57.73±1.44 60.86±1.27■◇◇ 57.49±1.38 39.04±2.51白藜蘆醇治療組 24 62.25±1.82## 68.13±2.49■■◇ 60.35±1.26## 40.84±2.36##橙皮苷治療組 24 55.18±1.14△△ 0.08±1.91△△■■ 71.22±2.13 61.16±2.39△△大黃酚治療組 24 59.94±1.22▲▲ 63.85±3.46◇ 59.06±1.36▲▲ 41.93±2.53▲▲大黃素治療組 24 59.46±0.88 61.13±1.51■◇ 58.58±1.21 38.60±2.52大黃酸治療組 24 57.80±1.31 9.91±1.29■■◇◇ 56.68±1.63 36.63±1.61維生素E對照組 24 63.24±1.65□ 68.84±4.78■■ 60.75±1.90□ 42.17±2.00□□模型組 6 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77正常組 6 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44

圖3 不同藥物不同濃度下對H2O2作用的肝細胞存活率影響

由表3和圖3可以發(fā)現(xiàn)：在25～100 μm范圍內(nèi)，升清膠囊六種單體均有一定的修復(fù)作用。當藥物濃度為200 μm時，除橙皮苷外，其他藥物表現(xiàn)出一定的細胞毒性，不僅沒有對損傷細胞修復(fù)，反而加重細胞的損傷。在六種單體中，橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚對H2O2造成的肝細胞氧化應(yīng)激有較好的修復(fù)作用，以橙皮苷效果最好，白藜蘆醇次之，大黃酚再次，均優(yōu)于大黃素、大黃酸和白藜蘆醇苷（P＜0.05或P＜0.01）。橙皮苷的最佳修復(fù)濃度為100 μm，其他藥物的最佳修復(fù)濃度均為50 μm。

3 討論

升清膠囊由生大黃、虎杖和陳皮三味中藥組成。生大黃的主要有效成分為蒽醌衍生物，如大黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及其結(jié)合物等。大黃附子湯（RAD）含藥血清能改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)的Caco-2細胞氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)[2]。虎杖的主要有效成分為大黃素為主的蒽醌類化合物，包括大黃素甲醚、大黃酚、白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、虎杖鞣質(zhì)、黃酮醇苷類物質(zhì)和草酸等[3]。現(xiàn)代藥理研究顯示虎杖有擴血管、抗血栓、抗休克、降血脂、抗感染、抗病毒、保肝、抗氧化的多重作用并且與大黃對降低膽道括約肌的緊張性有協(xié)同作用[4]?；⒄忍崛∥铮≒CE）可能通過靶向Keap1/ Nrf2途徑，降低果糖喂養(yǎng)大鼠的氧化應(yīng)激，防止肝臟脂質(zhì)積聚[5]。活性氧產(chǎn)生氧化應(yīng)激并促進結(jié)直腸癌的發(fā)生，陳皮具有通過誘導(dǎo)Nrf2來抑制細胞氧化應(yīng)激的能力，從而防止了偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸癌發(fā)生[6]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：1）H2O2對肝細胞的半數(shù)抑制濃度為300 μm，此時肝細胞受到一定程度的損傷，但仍具有活力。因此，后續(xù)實驗采用H2O2的作用濃度為300 μm、作用時間為1 h的模型條件下展開。2）升清膠囊六種單體白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸的IC50均＞150 μm，表明這六種單體對肝細胞的毒性小，安全性高；維生素E的IC50也＞200 μm；后續(xù)實驗使用的藥物濃度均在IC50范圍內(nèi)，以保證藥物對細胞的毒性最小化。3）在25～100 μm范圍內(nèi)，六種單體均有一定的修復(fù)作用，白藜蘆醇、橙皮苷和大黃酚對H2O2造成的肝細胞氧化應(yīng)激模型有較好的修復(fù)作用，橙皮苷效果最好，白藜蘆醇次之，大黃酚再次，均優(yōu)于大黃素、大黃酸和白藜蘆醇苷。4）橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚的最佳修復(fù)濃度分別為 100 μm、50 μm、50 μm；對照品VE的最佳修復(fù)濃度為50 μm。5）當藥物濃度在200 μm時，多數(shù)單體非但沒有表現(xiàn)出修復(fù)作用，反而表現(xiàn)出一定的細胞毒性，其原因可能是H2O2增大細胞膜的通透性，相同濃度（200 μm）的藥物進入氧化損傷細胞要多于正常細胞，從而造成細胞分裂的減緩和（或）細胞的死亡。6）H2O2對肝細胞半數(shù)抑制濃度為300 μm，升清膠囊六種單體對肝細胞的安全性都比較高，對H2O2造成的肝細胞氧化損傷均有一定的修復(fù)能力，其中橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚有較好的修復(fù)作用，其修復(fù)作用分別優(yōu)于、相當、次于VE。后續(xù)試驗將以橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚為三因素進行優(yōu)化組合，以三者分別最佳修復(fù)濃度的2/3、1/3、1/6為高（H）、中（M）、低（L）三個水平，采用正交設(shè)計和組分定量技術(shù)進行組合，并以VE最佳修復(fù)濃度全劑量作為對照展開。