蔡興龍，耿林玉，紀(jì)玥玥，賈佳，高碩，周萬(wàn)青(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 . 檢驗(yàn)科，. 風(fēng)濕免疫科，南京 210008)

哥倫比亞分枝桿菌(Mycobacteriumcolombiense)屬非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，為緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌，是鳥分枝桿菌復(fù)合群(M.aviumcomplex，MAC)中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)種[1]。該菌可致免疫缺陷患者或免疫功能正常患者淋巴結(jié)炎和皮膚播散性感染[2]。通過常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)甚至質(zhì)譜技術(shù)，很難對(duì)分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，尤其是一些新發(fā)現(xiàn)的菌種，常需借助分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)菌種水平鑒定。本研究報(bào)道1例哥倫比亞分枝桿菌致系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者體表感染案例，通過全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing，WGS)技術(shù)結(jié)合平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)分析實(shí)現(xiàn)菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1患者資料及菌株來源 患者女，52歲，因“間斷發(fā)熱，全身乏力，右膝破潰流膿加重兩月余”于2021年11月18日收住南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科?；颊呒韧?009年診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。入院查體：雙手關(guān)節(jié)變形，右手食指末端缺如，右腕關(guān)節(jié)腫脹，表面可見1 cm×2 cm大小包塊，皮溫稍高，觸之有波動(dòng)感；右膝關(guān)節(jié)上下可見數(shù)處皮膚缺損，周圍紅腫，表面滲液，右膝關(guān)節(jié)外側(cè)可見一大小約3 cm×4 cm缺損，中間呈黑色結(jié)痂，滲液較多，有臭味；右側(cè)小腿有2 cm×1 cm破潰，右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)1 cm×1.5 cm破潰。實(shí)驗(yàn)室檢查：WBC 2.90×109/L，Neu 94.8%，CD3+CD4+細(xì)胞22×106/L，B淋巴細(xì)胞7×106/L，C反應(yīng)蛋白112.10 mg/L，降鈣素原(PCT)0.81 ng/mL，白細(xì)胞介素-6(IL-6)70.21 pg/mL，血糖6.69 mmol/L，糖化血紅蛋白7.6%，結(jié)核T細(xì)胞γ干擾素陰性，G試驗(yàn)9.40 pg/mL，GM試驗(yàn)0.10，巨細(xì)胞病毒DNA<500 IU/mL，EB病毒DNA 2.27×104IU/mL。分泌物行革蘭染色、抗酸染色及培養(yǎng)，抗酸染色陽(yáng)性，培養(yǎng)獲得菌株經(jīng)WGS結(jié)合ANI分析鑒定為哥倫比亞分枝桿菌。右膝破潰處清創(chuàng)，碘伏消毒后高錳酸鉀濕敷，隔日換藥。異煙肼(0.6 g，qd)+利福平(0.45 g，tid)+阿奇霉素(0.5 g，qd)+乙胺丁醇(0.75 g，qd)+莫西沙星(0.4 g，qd)抗感染治療。12月13日，患者右膝關(guān)節(jié)數(shù)處破潰均無(wú)滲出及膿液，疼痛稍好轉(zhuǎn)，后應(yīng)家屬要求辦理出院。

1.2主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱、哥倫比亞血瓊脂平板(Thermo scientific公司)；Vitek MS微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑(法國(guó)生物梅里埃公司)；革蘭染色液、抗酸染色液(珠海貝索公司)；磁珠法細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物公司)；Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序系統(tǒng)(美國(guó)Illumina公司)。

1.3細(xì)菌培養(yǎng) 患者于11月18日和12月7日先后2次采集分泌物，右膝破潰處常規(guī)消毒處理破潰處后，用無(wú)菌拭子取深部分泌物送檢；分泌物標(biāo)本接種哥倫比亞血瓊脂平板置35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行涂片制備、革蘭染色與抗酸染色。

1.4質(zhì)譜鑒定 采用Vitek MS(V3.2)進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)菌落刮取并涂布在靶板上，滴加0.5 μL甲酸，干燥后滴加1 μL基質(zhì)液后行質(zhì)譜鑒定。

1.5WGS及ANI分析 采用磁珠法提取細(xì)菌總DNA，參照試劑說明書操作。委托上海生工生物公司使用Illumina HiSeq 2000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行WGS。提取核酸經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及濃度檢測(cè)合格后進(jìn)入文庫(kù)構(gòu)建，對(duì)樣本DNA進(jìn)行雙向測(cè)序(paired-end，PE)構(gòu)建450 bp文庫(kù)；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量剪切后，用SPAdes v3.13.0軟件(https://www.patricbrc.org/app/Assembly2)將序列進(jìn)行拼接，以得到最優(yōu)化組裝結(jié)果。采用RAST tool kit(RASTtk)(https://www.patricbrc.org/app/Annotation)進(jìn)行基因組注釋。采用ResFinder-4.1 Sever檢索耐藥基因攜帶情況(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)。采用OrthoANI方法(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進(jìn)行菌種鑒定[3]。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)及涂片結(jié)果 11月18日采集患者腿部分泌物樣本直接涂片行革蘭染色，可見大量革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陰性桿菌；抗酸染色見抗酸桿菌：3條/300個(gè)視野；經(jīng)培養(yǎng)分離鑒定出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。12月7日送檢分泌物直接涂片抗酸染色陽(yáng)性，革蘭染色未見明確菌體；接種哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)至7 d可見無(wú)色粗糙扁平小菌落生長(zhǎng)(編號(hào)MC230)(圖1)，培養(yǎng)物涂片抗酸染色呈陽(yáng)性(圖2)，革蘭染色不易著色；麥康凱平板不生長(zhǎng)，巧克力平板生長(zhǎng)。

圖1 哥倫比亞分枝桿菌血平板菌落形態(tài)(培養(yǎng)7 d)

圖2 菌落涂片抗酸染色(×1 000)

2.2質(zhì)譜鑒定 純菌落經(jīng)質(zhì)譜鑒定，未獲得鑒定結(jié)果。

2.3WGS、組裝和ANI分析 MC230基因組大小為5 671 138 bp，GC含量為67.93%，總基因數(shù)為5 399個(gè)，64條Contigs，N50：307 543 bp，N75：213 155 bp；47個(gè)tRNA，5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA各1個(gè)；全基因組序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank號(hào)為JALPSB000000000。經(jīng)ResFinder-4.1 Sever檢索分枝桿菌耐藥相關(guān)基因結(jié)果顯示，MC230基因組存在鏈霉素耐藥相關(guān)基因rrsg.462C>T。將MC230菌株全基因組序列進(jìn)行ANI分析，結(jié)果顯示與哥倫比亞分枝桿菌模式菌株CECT 3035的OrthoANI值為98.05%。

3 討論

哥倫比亞分枝桿菌最早于2006年由Murcia等[4]在哥倫比亞波哥大4名艾滋病患者的血液和痰標(biāo)本中分離并報(bào)道，為緩慢生長(zhǎng)型。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該菌廣泛分布于水環(huán)境和土壤中，并作為機(jī)會(huì)性感染病原菌累及患者淋巴結(jié)、肺部、皮膚、骨髓等部位[5]。本例患者患有多種自身免疫病及糖尿病，有糖皮質(zhì)激素、多種免疫抑制劑和廣譜抗生素使用史，上述均是感染NTM的高危因素。該患者右下肢出現(xiàn)多處相似的淺表性潰瘍，分泌物標(biāo)本直接涂片抗酸染色陽(yáng)性，推測(cè)可能發(fā)生了體表接觸性感染或者血流播散性感染。由于感染的經(jīng)久性，難免會(huì)混合細(xì)菌性感染。本患者首次采樣涂片可見抗酸染色菌體，但培養(yǎng)時(shí)因大量銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)很難搜尋分枝桿菌的菌落。在外科清創(chuàng)及消毒處理后再次采樣，去除細(xì)菌的干擾，并目標(biāo)性延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，終獲哥倫比亞分枝桿菌菌落。目前，尚無(wú)關(guān)于哥倫比亞分枝桿菌的推薦用藥，只能參考MAC的用藥指南，經(jīng)驗(yàn)性聯(lián)合使用克拉霉素、乙胺丁醇、利福平、異煙肼和阿奇霉素[6-7]。在1例兒童哥倫比亞分枝桿菌引起的皮膚感染患者治療過程中，使用克拉霉素0.5 g/d，利福平0.75 g/d，莫西沙星0.3 g/d，持續(xù)3個(gè)月，獲得很好改善[2]，與本病例使用方案相仿。

分枝桿菌的鑒定手段包括涂片抗酸染色、蛋白質(zhì)譜鑒定及分子鑒定。本例患者臨床標(biāo)本直接涂片抗酸染色呈陽(yáng)性，提示存在分枝桿菌感染。后續(xù)首先采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，但未獲得鑒定結(jié)果。經(jīng)核實(shí)，現(xiàn)使用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)缺乏哥倫比亞分枝桿菌鑒定譜，可見數(shù)據(jù)庫(kù)的完備性影響NTM的準(zhǔn)確鑒定[8]。當(dāng)然，正確的菌落預(yù)處理，包括破壁處理環(huán)節(jié)，也是獲得準(zhǔn)確鑒定的前提。依靠16S rRNA基因序列分析在分枝桿菌的菌種鑒別上有時(shí)無(wú)法獲得確切種的信息，時(shí)常需增補(bǔ)rpoB或hsp65基因。基于hsp65基因多態(tài)性分析、rpoB基因分析、DNA雜交和分枝桿菌細(xì)胞壁成分高效液相色譜法分析均有助于哥倫比亞分枝桿菌與其他MAC相鑒別[5,9]。而基于WGS結(jié)合ANI分析可獲得DNA雜交相似的菌種鑒定能力[10-11]。本研究對(duì)該分離菌株進(jìn)行基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其基因大小、GC含量及所編碼蛋白基因數(shù)量等均與已報(bào)道哥倫比亞分枝桿菌相似[12]?；贏NI分析，發(fā)現(xiàn)其與哥倫比亞模式菌株CECT 3035的OrthoANI值為98.05%，高于94%閾值[3]，由此可將MC230菌株鑒定為哥倫比亞分枝桿菌。在免疫抑制劑使用、免疫功能低下或艾滋病人群中遇到淺表皮膚難治性感染時(shí)，需考慮NTM和結(jié)核分枝桿菌的感染可能。對(duì)于NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷，可采取臨床標(biāo)本直接涂片抗酸染色獲得快速病原方向，而確切的菌種信息仍需經(jīng)培養(yǎng)后的蛋白分析或分子生物學(xué)手段獲得。