張莉，蔣麗瓊，馬鈞，鐘橋(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 .醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,.腎內(nèi)科，江蘇蘇州 215002)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是主要的糖尿病微血管并發(fā)癥之一。全世界新診斷為T2DM的患者中約有3%在診斷時(shí)已經(jīng)有明顯的腎病，約有20%～30%在晚年出現(xiàn)此類并發(fā)癥[1]。盡管DN的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響，但早期診斷后經(jīng)治療大多可延緩DN進(jìn)展。腎活檢作為DN早期診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因其侵創(chuàng)性，臨床應(yīng)用受限[2]。因此，DN早期診斷標(biāo)志物對(duì)于延緩疾病進(jìn)展具有重要意義。鑒于此，本研究擬圍繞血清和尿液腎功能標(biāo)志物，對(duì)T2DM、早期DN組以及臨床DN組進(jìn)行比較，探討尿液和血清腎功能指標(biāo)對(duì)DN早期診斷的價(jià)值，并構(gòu)建早期DN風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估列線圖模型。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院2019年1月至2021年12月收治的873例2型糖尿病(T2DM)患者，男456例，女417例；根據(jù)尿微量清蛋白與肌酐比值(urinary microalbumin-creatinine ratio，umACR)進(jìn)行分組：T2DM組，umACR<30 mg/g；早期DN組(DN1組)，30 mg/g≤umACR≤300 mg/g；臨床DN組(DN2組)，umACR>300 mg/g。DN診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)糖尿病腎臟病防治指南(2021年版)》[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有糖尿病急性并發(fā)癥、妊娠、炎癥、惡性腫瘤、泌尿系統(tǒng)疾病、自身免疫病、急慢性感染性疾病、長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及其他類型腎病等。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：K2020-042-H01)。

1.2主要儀器與試劑 7600全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；BNⅡ特定蛋白儀(德國(guó)西門子公司)；葡萄糖(glucose，Glu)、尿素(Urea)、肌酐(creatinine，Cr)、尿酸(uric acid，UA)試劑盒(日本日立公司)；糖化清蛋白(glycosylated albumin，GA)試劑盒(日本旭化成制藥株式會(huì)社)；尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(urinary N-acetyl-β-D glucosaminidase，uNAG)試劑盒、血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，CysC)試劑盒(北京利德曼公司)；尿微量清蛋白(urinary microalbumin，umAlb)、尿α1-微球蛋白(urinary α1-Microglobulin，uα1-MG)、尿β2微球蛋白(urinary β2-Microglobulin，uβ2-MG)、尿免疫球蛋白G(urinary immunoglobulin G，uIgG)、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(urinary transferrin，uTrF)試劑盒(德國(guó)西門子公司)。

1.3標(biāo)本采集與檢測(cè) 所有研究對(duì)象空腹12 h后采集靜脈血，室溫靜置30 min，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min分離血清，2 h內(nèi)完成檢測(cè)。所有研究對(duì)象均留取晨起清潔中段尿10 mL，2 000 r/min離心20 min，收集上清液，2 h內(nèi)完成檢測(cè)。不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本離心后，4 ℃放置不超過(guò)24 h。

采用7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Glu(己糖激酶法)、GA(酶法)、Urea(尿素酶法)、UA(尿酸酶法)、Cr(肌酐酶法)、CysC(免疫比濁法)、uNAG(連續(xù)監(jiān)測(cè)法)。采用BNⅡ特定蛋白儀用免疫散射比濁法檢測(cè)umAlb、uα1-MG、uβ2-MG、uIgG和uTrF。操作均遵循本室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。根據(jù)慢性腎臟病流行病合作組(chronic kidney disease epidemiology collaboration，CKD-EPIsCr/CysC)公式[4]，估算腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。

2 結(jié)果

2.1患者的一般資料 見(jiàn)表1。除外性別和Glu，3組患者年齡、GA、Urea、Cr、UA、CysC和eGFR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與T2DM組比較，其他2組患者年齡、Urea、UA和CysC水平升高，eGFR水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與DN1組比較，DN2組Urea、Cr、UA和CysC水平升高，eGFR水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；T2DM組與DN1組Cr差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組患者一般資料比較

2.2尿液腎功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。除外uNAG，3組患者umACR、umAlb、uα1-MG、uβ2-MG、uIgG和uTrF水平：DN2組>DN1組>T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表2 3組患者尿腎功能指標(biāo)比較

2.3各指標(biāo)對(duì)早期DN診斷價(jià)值的ROC曲線分析 以早期DN患者作為疾病組，T2DM組作為對(duì)照組，繪制除umACR和umAlb之外的其他指標(biāo)評(píng)估早期DN診斷價(jià)值的ROC曲線，計(jì)算約登指數(shù)最大時(shí)各指標(biāo)的截?cái)嘀?。結(jié)果提示，血清CysC和eGFR的AUCROC分別為0.626和0.622；尿液中以u(píng)TrF的AUCROC最高，為0.868，其次是uIgG。當(dāng)6個(gè)指標(biāo)聯(lián)合時(shí)，AUCROC達(dá)到最大值，為0.904，當(dāng)CysC+uIgG+uTrF聯(lián)合時(shí)AUCROC為0.893。見(jiàn)圖1和表3。

圖1 uTrF、uIgG和CysC單獨(dú)及其聯(lián)合檢測(cè)診斷DN的ROC曲線

表3 各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)DN患者的ROC曲線分析

2.4各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析 uα1-MG、uβ2-MG、血清CysC、uIgG、uTrF和umAlb與umACR呈正相關(guān)，r依次為0.47、0.35、0.44、0.73、0.87和0.89，P均<0.001；uα1-MG、uβ2-MG、血清CysC、uIgG、uTrF和umAlb與eGFR呈負(fù)相關(guān)，r依次為-0.42、-0.29、-0.82、-0.36、-0.34、-0.37，P均<0.001。

2.5DN的多因素Logistic逐步回歸分析 以DN=1，T2DM=0分組作為因變量，通過(guò)多因素逐步Logistic回歸對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行單因素分析，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量納入多因素回歸分析。年齡按照≤45歲、46～59歲、≥60歲設(shè)置啞變量，其他連續(xù)型變量按照截?cái)嘀缔D(zhuǎn)換成分類變量，剔除由CysC估算的eGFR(共線性)。結(jié)果顯示，年齡、uβ2-MG、uIgG、uTrF、uα1-MG和CysC是DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。60歲以上的T2DM患者進(jìn)展為DN的風(fēng)險(xiǎn)是45歲以下人群的2.838倍。

表4 DN的多因素Logistic逐步回歸分析

2.6構(gòu)建Nomogram模型和驗(yàn)證 將上述DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素納入診斷模型，用R軟件建立評(píng)估DN風(fēng)險(xiǎn)的列線圖模型，見(jiàn)圖2A，其中一致性指數(shù)C-index為0.919。采用Bootstrap內(nèi)部驗(yàn)證法進(jìn)一步分析模型校準(zhǔn)度，見(jiàn)圖2B，校準(zhǔn)曲線顯示了預(yù)測(cè)概率與實(shí)際觀察概率，Brier分?jǐn)?shù)為0.104。

注：A,評(píng)估DKD發(fā)生概率的列線圖模型；B,校準(zhǔn)曲線。圖2 評(píng)估DN發(fā)生概率的Nomogram列線圖模型和校準(zhǔn)曲線

運(yùn)用實(shí)例：患者，男性，56歲，因“口干、多飲、多尿”1月余入院，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果：年齡56歲、uα1-MG 24.2 mg/L、uβ2-MG < 0.177 mg/L、uIgG 24.6 mg/L、uTrF 8.25 mg/L和血清CysC 0.77 mg/L，其投射至列線圖上的分?jǐn)?shù)分別為16、22、0、18、87.5和0分，總分為143.5分，對(duì)應(yīng)DN患病概率為87.0%。

3 討論

據(jù)報(bào)道，有20%～40%的DM患者合并DN，發(fā)展為終末期腎病(end-stagerenal disease，ESRD)的發(fā)生率約為10/1 000人年，我國(guó)T2DM患者的DN患病率為21.8%[3,5]。DN患者臨床上以持續(xù)清蛋白尿和(或)eGFR進(jìn)行性下降為主要特征，但是部分糖尿病患者未出現(xiàn)尿液清蛋白排泄異常，卻已經(jīng)存在eGFR下降。尿umAlb雖然被廣泛應(yīng)用于臨床，umACR也是診斷DN的重要指標(biāo)，但其測(cè)定受多種因素影響，如感染、發(fā)熱、酮癥、高血糖、高血壓、心力衰竭、利尿劑使用、月經(jīng)以及劇烈運(yùn)動(dòng)等。Klessens等[6]借助腎活檢技術(shù)發(fā)現(xiàn)106例病理符合DN的患者中有20例始終沒(méi)有出現(xiàn)蛋白尿，由此可見(jiàn)尿umAlb預(yù)測(cè)DN具有局限性。傳統(tǒng)腎功能診斷指標(biāo)只有腎功能失代償期才有明顯變化，探尋有價(jià)值的診斷指標(biāo)對(duì)于DN早期診斷并實(shí)施早期干預(yù)對(duì)于減少ESRD的發(fā)生具有重要意義。

多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，血清CysC、uα1-MG和uβ2-MG是DN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且以上3種指標(biāo)在T2DM組、早期DN組和臨床DN組逐漸升高(P均<0.05)，說(shuō)明其在DN早期就開(kāi)始異常，且隨著病程進(jìn)展而不斷升高。CysC是一種反映eGFR變化的理想的內(nèi)源性標(biāo)志物，基于CKD-EPIsCr/CysC計(jì)算的eGFR，敏感性、特異性和準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于sCr，使更多早期CKD患者和umAlb正常的CKD患者得以確診[7]。Yassine等[8]研究認(rèn)為DN患者CysC含量較T2DM組和正常對(duì)照組升高，并強(qiáng)調(diào)其在CKD進(jìn)展中的作用，與本研究結(jié)果一致。血液中的β2-MG和游離的α1-MG均可自由通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，絕大部分在腎近曲小管重吸收和代謝，只有微量從終尿排出[9]。DN早期腎損害可僅表現(xiàn)為腎小球肥大和血流動(dòng)力學(xué)紊亂，但大多數(shù)T2DM伴有代謝綜合征，表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)、腎內(nèi)血管病變與腎小球病變的異質(zhì)性，導(dǎo)致GFR降低，腎小管重吸收功能障礙，血、尿β2-MG水平均升高。Satirapoj等[10]認(rèn)為腎小管損害標(biāo)志物與DN預(yù)后密切相關(guān)，可測(cè)定腎小管損害標(biāo)志物，如CysC、β2-MG、α1-MG、視黃醇結(jié)合蛋白、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、腎損傷分子1等。此外，Jiang等[11]研究認(rèn)為，α1-MG和β2-MG與eGFR顯著相關(guān)，可能在DN的發(fā)展中起重要作用。本文發(fā)現(xiàn)eGFR與uα1-MG呈負(fù)相關(guān)(r=-0.42)，而與uβ2-MG呈弱相關(guān)。

蛋白質(zhì)通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜需經(jīng)過(guò)選擇性體積屏障和排斥性電荷屏障。在DN發(fā)生早期，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜分離，上皮細(xì)胞足突融合，進(jìn)而腎小球?yàn)V過(guò)膜孔徑增大，濾過(guò)膜體積屏障受損；同時(shí)腎小球?yàn)V過(guò)膜因糖基化作用使帶負(fù)電荷的唾液酸和硫酸肝素減少，導(dǎo)致電荷屏障受損。因此中分子的TrF(相對(duì)分子質(zhì)量77 000，PI=5.7)經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)膜濾過(guò)，出現(xiàn)在尿液中。TrF帶負(fù)電荷少于Alb(相對(duì)分子質(zhì)量66 000，PI=4.7)，在糖尿病腎損害早期uTrF比umAlb更易大量出現(xiàn)于尿中。uTrF在單項(xiàng)診斷指標(biāo)中AUCROC最高，達(dá)到0.868，Nomogram列線圖中uTrF是診斷DN的主要危險(xiǎn)因素。Mohan等[12]在研究中指出，尿IgG增高提示嚴(yán)重的腎損傷，本研究發(fā)現(xiàn)早期DN組有57.8%患者uIgG升高，62.6%的患者uTrF升高，說(shuō)明患者出現(xiàn)輕度蛋白尿時(shí)，uIgG和uTrF已經(jīng)出現(xiàn)，對(duì)判斷腎小球損傷具有較高的敏感性。宗書(shū)等[13]研究認(rèn)為，uIgG在輕度腎損傷時(shí)即出現(xiàn)升高，與本研究結(jié)果一致。uTrF和uIgG與umACR呈強(qiáng)正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，因此無(wú)論是按照umACR分期，還是依據(jù)eGFR判斷疾病病程，uTrF和uIgG水平在DN進(jìn)展中都起到一定作用。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于預(yù)測(cè)DN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的列線圖模型的報(bào)道并不多，侯新月等[14]基于糖尿病病程、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、貧血、甲狀腺激素等指標(biāo)建立的DN預(yù)測(cè)模型指出對(duì)甄別DN高風(fēng)險(xiǎn)人群，制訂干預(yù)對(duì)策具有指導(dǎo)意義。國(guó)外報(bào)道將高血壓、藥物使用、病程、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)指數(shù)、紅細(xì)胞分布寬度等納入DN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[15-16]。本研究納入診斷模型的指標(biāo)與上述報(bào)道不同，研究方法類似。本研究存在一定的局限性，沒(méi)有按照腎穿刺活檢確診，而是依靠病程和病歷記錄來(lái)進(jìn)行回顧性分析研究，依靠umACR水平分組，沒(méi)有納入正常清蛋白尿DN，可能存在一定偏倚。但是鑒于腎活檢不適用于DN的篩查，T2DM患者因常合并高血壓、肥胖、脂代謝紊亂，腎損害病理特征不典型。本研究基于873例T2DM患者，分析了腎小球與腎小管的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并從中選取有價(jià)值的指標(biāo)建立DN診斷模型，將Logistic回歸結(jié)果可視化，更直觀地應(yīng)用于個(gè)體疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)，有助于臨床及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期DN患者或高風(fēng)險(xiǎn)人群，及時(shí)干預(yù)治療，減少ESRD的發(fā)生。