金麗，黃永祿，李佳萍，蔣陳晨，周宏偉，張嶸，胡燕燕(1. 臨海市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江臺(tái)州 17000；. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 10009；. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 10006)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)通過(guò)檢測(cè)待檢病原菌株蛋白質(zhì)以獲取其質(zhì)譜峰結(jié)果，同時(shí)對(duì)比龐大的菌株數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株的蛋白質(zhì)譜峰從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同菌株的鑒定[1]。MALDI-TOF MS技術(shù)給微生物檢驗(yàn)帶來(lái)最大的變革是細(xì)菌的鑒定能力大大提高，使得微生物檢驗(yàn)跨入一個(gè)飛速發(fā)展的新時(shí)代。大量文獻(xiàn)報(bào)道，MS技術(shù)對(duì)臨床細(xì)菌的鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上[2-3]。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上商品化的微生物鑒定MS儀主要是德國(guó)布魯克公司的Biotyper MS和法國(guó)生物梅里埃公司的Vitek MS。近年來(lái)國(guó)產(chǎn)MS儀的發(fā)展也非常迅速，質(zhì)譜市場(chǎng)上新興的國(guó)產(chǎn)MS儀主要包括Clin-TOF MS(北京毅新博創(chuàng)生物有限公司)、M-Discover 100(珠海美華科技有限公司)以及Autof ms1000(安圖生物公司)、microTyper MS(江蘇天瑞儀器股份有限公司)、ATSA MicroIDSys(上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)等。Smart MS 5020型MALDI-TOF MS是珠海迪爾生物工程有限公司于2021年上市的國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)，目前在國(guó)內(nèi)還缺乏全面的臨床微生物鑒定性能評(píng)估。本研究對(duì)其在臨床細(xì)菌真菌方面的鑒定效能進(jìn)行評(píng)估，以期為今后臨床使用提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 共納入2016—2020年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院留存的臨床分離菌株913株，包括革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌以及酵母樣真菌，覆蓋18個(gè)屬，48個(gè)種或復(fù)合群，包含臨床上難區(qū)分的鏈球菌、嗜血桿菌以及常見(jiàn)的復(fù)合群等。其中，包括革蘭陰性菌20種456株，革蘭陽(yáng)性菌26種387株，以及酵母菌6種70株。并選取浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院保存的13株室內(nèi)質(zhì)控菌株用于重復(fù)性評(píng)估，包括革蘭陰性菌5株，革蘭陽(yáng)性菌6株以及酵母菌2株。

1.1.2試劑與儀器 Biotyper MS型MALDI-TOF質(zhì)譜儀及搭載的DB2969數(shù)據(jù)庫(kù)及其配套試劑(德國(guó)布魯克公司)，Smart MS 5020型MALDI-TOF 質(zhì)譜儀及搭載的臨床微生物菌種鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)(2 630種)及其配套試劑(珠海迪爾公司)，基因組提取試劑盒(美國(guó)Axygen公司)，PCR配套相關(guān)試劑(上海生工生物公司和日本TaKaRa公司)，ABI 3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)，Illumina HiSeqX10測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)。

1.2方法

1.2.1復(fù)蘇培養(yǎng) 所有保存菌株復(fù)蘇后，根據(jù)菌種要求分別轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)、巧克力培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)或沙氏培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)，35 ℃溫育18～24 h，生長(zhǎng)緩慢細(xì)菌需適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2種質(zhì)譜系統(tǒng)的準(zhǔn)確性評(píng)估方法采用直接涂抹法平行使用2套質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)研究菌株進(jìn)行菌種鑒定。取少量純培養(yǎng)菌直接涂抹于靶板，滴加1 μL基質(zhì)液(即α-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA)；酵母菌先滴加1 μL 70%甲酸溶液，干燥后再加1 μL基質(zhì)液。自然干燥后上機(jī)采集圖譜并鑒定分析。13株室內(nèi)質(zhì)控菌株在Smart MS 5020系統(tǒng)進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每株菌平行檢測(cè)3次。

1.2.3結(jié)果判定 根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明。Biotyper MS系統(tǒng)鑒定分值≥2.000為鑒定至種水平可信；分值在1.700～1.999之間為鑒定屬水平可信；分值<1.700無(wú)鑒定結(jié)果。Smart MS 5020系統(tǒng)鑒定分值≥2.00為鑒定種水平結(jié)果可信；分值在1.70～1.99之間為鑒定屬水平結(jié)果可信；分值<1.700為鑒定結(jié)果不可信。

當(dāng)某一種或2種MS系統(tǒng)鑒定失敗或2種質(zhì)譜鑒定結(jié)果不一致時(shí)，進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)，反應(yīng)條件及體系參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行?；蛱崛“凑栈蚪M提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像儀分析，并將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)，確定菌種類(lèi)型。

針對(duì)復(fù)合群，本次評(píng)估包括鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群、陰溝腸桿菌復(fù)合群以及肺炎克雷伯菌復(fù)合群，采用二代測(cè)序方法確認(rèn)鑒定結(jié)果?；蛱崛“凑栈蚪M提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將提取的基因組DNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司，采用Illumina HiseqX10測(cè)序平臺(tái)通過(guò)雙末端150 bp測(cè)序讀長(zhǎng)策略進(jìn)行高通量測(cè)序，原始序列用SPAdes v3.12.0軟件進(jìn)行基因組組裝[5]。拼接好的基因組序列與基因文庫(kù)(https://pubmlst.org/software/bigsdb)比對(duì)，確定菌種類(lèi)型。以此作為復(fù)合群鑒定結(jié)果的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3術(shù)語(yǔ)定義

1.3.1準(zhǔn)確鑒定 Smart MS 5020系統(tǒng)鑒定分值≥2.00，系統(tǒng)鑒定結(jié)果可信，并與參考方法鑒定結(jié)果種水平一致。針對(duì)某些菌復(fù)合群內(nèi)各種蛋白質(zhì)指紋圖譜極相似，因此種鑒定正確和復(fù)合群鑒定正確均認(rèn)定為“準(zhǔn)確鑒定”。本研究涉及的菌復(fù)合群：(1)鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群[6]：鮑曼不動(dòng)桿菌(A.baumannii)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(A.calcoaceticus)、醫(yī)院不動(dòng)桿菌(A.nosocomialis)、賽氏不動(dòng)桿菌(A.seifertii)以及皮氏不動(dòng)桿菌(A.pittii)；(2)陰溝腸桿菌復(fù)合群[7]：陰溝腸桿菌(E.cloacae)、阿氏腸桿菌(E.asburiae)、霍氏腸桿菌(E.hormaechei)、神戶(hù)腸桿菌(E.kobei)、路氏腸桿菌(E.ludwigii)、超壓腸桿菌(E.nimipressuralis)以及桑腸桿菌(E.mori)；(3)肺炎克雷伯菌復(fù)合群[8]：肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、變棲克雷伯菌(K.variicola)、類(lèi)肺炎克雷伯菌(K.quasipneumoniae)、密歇根克雷伯菌(K.michiganensis)等。

1.3.2鑒定至屬水平 Smart MS 5020系統(tǒng)鑒定分值為1.70～1.99，或提供菌屬名稱(chēng)，并且結(jié)果與參考方法屬水平一致。

1.3.3鑒定失敗 Smart MS 5020系統(tǒng)鑒定分值<1.700，為不可信結(jié)果，認(rèn)為鑒定失敗。

1.3.4鑒定錯(cuò)誤 系統(tǒng)認(rèn)為鑒定結(jié)果可信，但與參考方法鑒定結(jié)果不一致。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較均采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12種系統(tǒng)的鑒定準(zhǔn)確率比對(duì) 經(jīng)16S rRNA和二代測(cè)序方法鑒定，913株臨床菌株具體分類(lèi)見(jiàn)表1。Biotyper MS系統(tǒng)種水平鑒定準(zhǔn)確率為100%(913/913，95%CI：99.48%～99.58%)，Smart MS 5020系統(tǒng)種水平鑒定準(zhǔn)確率為99.78%(911/913，95%CI：99.12%～99.20%)，2株表皮葡萄球菌鑒定為柯氏葡萄球菌。在臨床微生物的鑒定能力方面，2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.501，P=0.479)。

表1 菌株信息

2.1.1革蘭陰性菌 Smart MS 5020系統(tǒng)對(duì)12個(gè)屬20種細(xì)菌共456 株革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率均達(dá)到100%(456/456，95%CI：98.96%～99.16%)，其中鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群(29株)，陰溝腸桿菌復(fù)合群(30株)和肺炎克雷伯菌復(fù)合群(113株)在本次評(píng)價(jià)中均鑒定到種或復(fù)合群水平。

2.1.2革蘭陽(yáng)性菌 Smart MS 502系統(tǒng)對(duì)4個(gè)屬26種共387 株革蘭陽(yáng)性菌的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到99.4%(385/387，95%CI：97.93%～98.13%)，其中2株表皮葡萄球菌鑒定錯(cuò)誤，鑒定為柯氏葡萄球菌。

2.1.3酵母樣真菌 Smart MS 5020系統(tǒng)對(duì)臨床常見(jiàn)70株酵母樣真菌的種水平鑒定準(zhǔn)確率均為100%(70/70，95%CI：93.52%～94.8%)。

2.1.4復(fù)合群 2種質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群的19株鮑曼不動(dòng)桿菌和10株皮氏不動(dòng)桿菌均能準(zhǔn)確鑒定到種。質(zhì)譜對(duì)陰溝腸桿菌復(fù)合群中具體菌種的鑒定能力存在一定缺陷，雖然2種質(zhì)譜系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中均包含5種常見(jiàn)的陰溝腸桿菌復(fù)合群具體種(阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、霍氏腸桿菌、神戶(hù)腸桿菌和路氏腸桿菌)，此次納入鑒定的共30株陰溝腸桿菌復(fù)合群(5株阿氏腸桿菌、8株陰溝腸桿菌、10株霍氏腸桿菌、6株神戶(hù)腸桿菌和1株路氏腸桿菌)，Smart MS 5020僅7株準(zhǔn)確鑒定到種，Biotyper MS系統(tǒng)10株能準(zhǔn)確鑒定到種。113株肺炎克雷伯菌及其亞種包含109株肺炎克雷伯菌、4株類(lèi)克雷伯菌及1株密歇根克雷伯氏菌，均鑒定為肺炎克雷伯菌(表2)，這是由于兩者質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)存在缺失(僅包含有肺炎克雷伯菌和變棲克雷伯菌)以及種內(nèi)親緣性太近導(dǎo)致。

表2 2種質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)復(fù)合群鑒定結(jié)果比較

2.2重復(fù)性評(píng)估 選取ATCC25922(大腸埃希菌)、ATCC700603(肺炎克雷伯菌)、ATCC 27853(銅綠假單胞菌)、ATCC25923(金黃色葡萄球菌)、ATCC29213(金黃色葡萄球菌)、ATCC29212(糞腸球菌)、ATCC700327(鉛黃腸球菌)、ATCC49619 (肺炎鏈球菌)、ATCC19615(化膿鏈球菌)、ATCC19424(腦膜炎奈瑟菌)、ATCC49247(流感嗜血桿菌)、ATCC14053(白色念珠菌)和ATCC60032(光滑念珠菌)共13 株室內(nèi)質(zhì)控菌株和臨床分離菌株進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每株菌經(jīng)3次平行試驗(yàn)后，鑒定結(jié)果100%符合。

3 討論

隨著近幾年國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜的崛起，對(duì)于國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜的性能評(píng)估也多有報(bào)道[9-12]。Smart MS 5020型質(zhì)譜搭載2 630種數(shù)據(jù)庫(kù)，是珠海迪爾公司在2021年注冊(cè)上市的質(zhì)譜系統(tǒng)，目前暫無(wú)該質(zhì)譜對(duì)臨床菌株的鑒定效能評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)99.78%(911/913)，性能相當(dāng)優(yōu)異。僅2株表皮葡萄球菌被錯(cuò)誤鑒定為柯氏葡萄球菌，可能是由于挑取細(xì)菌量、涂板厚薄差異等，導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)微弱變化而被錯(cuò)誤鑒定。文獻(xiàn)顯示質(zhì)譜鑒定嗜血桿菌屬時(shí)容易發(fā)生混淆，如Vitek MS將42%(21/50)的溶血嗜血桿菌鑒定為流感嗜血桿菌[13]；布魯克Biotyper MS DB2371數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)流感嗜血桿菌的鑒定錯(cuò)誤率為13.1%(47/358)，通過(guò)將更多參考菌株納入Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)中，可將鑒定準(zhǔn)確率提高至100%[14]。Smart MS 5020系統(tǒng)對(duì)此次納入鑒定的65株嗜血桿菌均能準(zhǔn)確鑒定到種。國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建起步較晚，在數(shù)據(jù)庫(kù)方面還需進(jìn)一步完善。但隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，相信其數(shù)據(jù)庫(kù)不斷擴(kuò)增將帶來(lái)更優(yōu)異的鑒定性能。

對(duì)于臨床常見(jiàn)的復(fù)合群，有不少文獻(xiàn)評(píng)估了質(zhì)譜對(duì)復(fù)合群內(nèi)具體種的區(qū)分能力。鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群各菌種因表型相似，生化試驗(yàn)無(wú)法區(qū)分，但目前有研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群不同菌種對(duì)抗菌藥物的耐藥性存在差異[15]，且預(yù)后也有所差別，因此若能將該復(fù)合群準(zhǔn)確鑒定至種對(duì)臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義。有報(bào)道評(píng)估了Vitek MS和Biotyper MS對(duì)144株鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群的區(qū)分能力，兩者分別準(zhǔn)確識(shí)別129株(89.6%)和143株(99.3%)，顯示對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群具體種的區(qū)分能力較高，但文獻(xiàn)也提出需要擴(kuò)大其數(shù)據(jù)庫(kù)以達(dá)到更好的區(qū)分能力[16]。本研究共納入29株鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群，包括19株鮑曼不動(dòng)桿菌和10株皮氏不動(dòng)桿菌，Smart MS 5020系統(tǒng)均準(zhǔn)確鑒定到種，但由于未包含復(fù)合群中其他種，因此對(duì)群內(nèi)其他種的鑒定能力還有待評(píng)估。陰溝腸桿菌復(fù)合群可導(dǎo)致多種感染，常存在于環(huán)境以及人和動(dòng)物的共生腸道菌群中，是重要的條件致病菌之一[17]。陰溝腸桿菌復(fù)合群的分類(lèi)也在不斷變化，以hsp60基因測(cè)序作為區(qū)分復(fù)合群內(nèi)具體種的參考方法[18]。陰溝腸桿菌復(fù)合群內(nèi)種類(lèi)多，親緣關(guān)系近，Biotyper MS自帶商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)陰溝腸桿菌內(nèi)具體種鑒定準(zhǔn)確率僅為25%[19]，與本實(shí)驗(yàn)Biotyper MS鑒定準(zhǔn)確率[33.3%(10/30)]相當(dāng)，Smart MS 5020系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率也僅為23.3%(7/30)。目前采用質(zhì)譜方法區(qū)分陰溝腸桿菌復(fù)合群還需進(jìn)一步補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)及更精密的算法。肺炎克雷伯菌復(fù)合群是近幾年提出的概念，肺炎克雷伯菌是全球與抗生素耐藥性相關(guān)最嚴(yán)重的的病原體之一，其在系統(tǒng)發(fā)育上與變棲克雷伯菌(K.variicola)、類(lèi)肺炎克雷伯菌(K.quasipneumoniae)、密歇根克雷伯菌(K.michiganensis)密切相關(guān)，并與其他幾類(lèi)未命名亞型共同構(gòu)成了肺炎克雷伯菌復(fù)合群[20]。目前，關(guān)于肺炎克雷伯菌復(fù)合群具體種的臨床意義還沒(méi)有精確定義，現(xiàn)有商業(yè)化質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中僅包含肺炎克雷伯菌復(fù)合群中少量菌種，如Biotyper MS包含肺炎克雷伯菌和變棲克雷伯菌，Vitek MS僅包含肺炎克雷伯菌，因此采用商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肺炎克雷伯菌復(fù)合群進(jìn)行具體種區(qū)分存在困難。文獻(xiàn)報(bào)道可采用特征峰方法[21]，如類(lèi)肺炎克雷伯菌在m/z為4 136和8 271處存在特征峰，變棲克雷伯菌在m/z為7 768處存在特征峰，通過(guò)該方法區(qū)分肺炎克雷伯菌復(fù)合群具體種的敏感性和特異性范圍為80%～100%和97%～100%。另外，文獻(xiàn)報(bào)道黏液性肺炎克雷伯菌和黏液性銅綠假單胞菌難以用MALDI-TOF MS方法鑒定[22]，而本文中肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌均被準(zhǔn)確鑒定，可能與本研究中黏液性菌株納入較少，以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)更新有關(guān)。由于數(shù)據(jù)庫(kù)存在缺失和種內(nèi)親緣關(guān)系近，Smart MS 5020將類(lèi)肺炎克雷伯菌和密歇根克雷伯菌鑒定為肺炎克雷伯菌。對(duì)于這類(lèi)復(fù)合群，需要進(jìn)一步更新數(shù)據(jù)庫(kù)。

Smart MS 5020在種水平鑒定準(zhǔn)確率高，對(duì)臨床常見(jiàn)及易混淆菌種均可快速給出可靠的鑒定結(jié)果，但對(duì)復(fù)合群具體種數(shù)據(jù)庫(kù)還存在缺陷，需要進(jìn)一步擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫(kù)以期獲得更好鑒定性能。