李靜 梁亞萍 鄒遠(yuǎn)嫵 張思琪 鄭見寶 仵倩紅

2020年，全球共發(fā)現(xiàn)約1000萬例結(jié)核病患者，其中20%的肺結(jié)核患者合并肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis, EPTB)，而腸結(jié)核約占EPTB患者的10%[1]。腸結(jié)核通常來自腸內(nèi)原發(fā)病灶，臨床癥狀與克羅恩病和腸癌等非常相似，易誤診誤治、診斷延遲、治療效果不理想[2]。腸結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腸黏膜組織標(biāo)本培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌[3]，但目前篩查較好的內(nèi)窺鏡技術(shù)(結(jié)腸鏡檢查和盲回腸活檢)因其為侵入性檢查而受到大多數(shù)患者的抵觸[4]，而放射學(xué)檢查中CT掃描或磁共振成像MRI)的診斷率又非常低，故臨床診斷腸結(jié)核主要依賴于典型的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測。

傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測中抗酸桿菌涂片法快速、價(jià)格低但敏感度低，分枝桿菌培養(yǎng)周期長、不能滿足臨床早期快速診治的需求，加之糞便標(biāo)本載菌量又較少，兩種方法的陽性檢出率均較低，故尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度、高特異度的實(shí)驗(yàn)室診斷方法一直是腸結(jié)核診斷的重要目標(biāo)。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)是以全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpoB基因?yàn)榘谢?，可? h內(nèi)同時(shí)快速檢測結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性，已作為新型分子診斷技術(shù)被很多研究者推薦用于EPTB的診斷[5-6]，但Xpert用于糞便樣本的檢測數(shù)據(jù)還相對(duì)有限，故筆者通過比較Xpert、濃縮集菌漂浮法涂片鏡檢(簡稱“集菌法”)、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)對(duì)腸結(jié)核患者糞便標(biāo)本的檢測結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)估Xpert檢測糞便標(biāo)本對(duì)腸結(jié)核的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性收集2019年8月至2022年5月陜西省結(jié)核病防治院收治的135例疑似腸結(jié)核患者糞便標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測資料，納入同時(shí)對(duì)患者糞便標(biāo)本采用集菌法、MGIT 960培養(yǎng)和Xpert檢測的98例疑似腸結(jié)核患者，其中男性68例(69.4%)、女性30例(30.6%)。所有患者臨床資料均來源于臨床原始病例記錄。

二、 研究方法

1.腸結(jié)核患者診斷依據(jù)[7]：(1)有發(fā)熱、腹痛、腹瀉、腹脹或腹瀉與便秘交替等及伴有結(jié)核中毒癥狀；(2)腸鏡下發(fā)現(xiàn)有黏膜充血、水腫、環(huán)形潰瘍，潰瘍邊緣不齊呈鼠咬狀，伴有大小及形態(tài)各異的炎癥息肉，腸腔變窄；(3)病理切片可找到干酪樣壞死；(4)糞便或黏膜組織分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(5)診斷性抗結(jié)核治療有效。符合第1條和(或)第2條，同時(shí)滿足第3～5條中任意1條即可確診。

2.主要試劑和儀器：抗酸染色試劑為實(shí)驗(yàn)室自配萋尼染色試劑；MGIT 960檢測系統(tǒng)所用培養(yǎng)儀及試劑均由美國BD公司提供；Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)及配套試劑盒均購于美國Cepheid公司。

3.實(shí)驗(yàn)室檢測方法：按照標(biāo)本采集的要求收集留取糞便標(biāo)本至少5 ml，每份標(biāo)本均進(jìn)行集菌法、MGIT 960培養(yǎng)和Xpert檢測。(1)集菌法：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]操作。將糞便標(biāo)本用高壓蒸汽(1.0 kg/cm2，121.3 ℃)滅菌30 min后，取出放冷，加入半瓶蒸餾水混勻于振蕩器上振蕩10 min，拿出后加入0.5 ml二甲苯充分振蕩后靜置，將蒸餾水添加至滿而不溢，再蓋上提前準(zhǔn)備好的涂抹血漿(大小約為1×2 cm)的玻片，漂浮1 h后取下放置在玻片架上干燥后行萋尼染色鏡檢，按照檢驗(yàn)規(guī)程報(bào)告結(jié)果。(2)MGIT 960培養(yǎng)：嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]操作。取2 ml糞便標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH；終濃度為1.5%，原始濃度為6% NaOH)消化去污處理后，室溫靜置15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.8)中和后再以3000×g離心15 min，棄上清，2 ml PBS緩沖液重懸沉淀物，取0.5 ml重懸液接種至MGIT 960培養(yǎng)管中，加入0.8 ml營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。將接種好的MGIT 960培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)中孵育，儀器對(duì)分枝桿菌的生長進(jìn)行自動(dòng)監(jiān)測。MGIT 960培養(yǎng)儀報(bào)陽后經(jīng)涂片鏡檢確定為分枝桿菌，再采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(MPB64)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[9]。(3)Xpert檢測：嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行檢驗(yàn)。將1 ml糞便標(biāo)本與2 ml Xpert MTB/RIF系統(tǒng)前處理液混合，擰緊瓶蓋，渦旋振蕩15 s，室溫靜置15 min，使標(biāo)本充分液化沉淀后，3000×g離心3 min用無菌吸管吸取2 ml上清樣品加入Xpert MTB/RIF系統(tǒng)測試盒中，上機(jī)檢測，約2 h報(bào)告結(jié)果。

4.質(zhì)量控制：(1)室內(nèi)質(zhì)控：有完整的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部操作規(guī)程；實(shí)驗(yàn)人員培訓(xùn)合格持證上崗；試劑使用、配制做好相關(guān)記錄，核對(duì)批號(hào)及使用期限；儀器定期保養(yǎng)有使用、檢測、維修等記錄；嚴(yán)把標(biāo)本收集容器、性質(zhì)、時(shí)間、保存的每個(gè)關(guān)口；用已知陽性級(jí)別和陰性結(jié)果的涂片進(jìn)行質(zhì)量控制；(2)室間質(zhì)控：每年參加中國疾病預(yù)防控制中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、熟練度測試及北京聯(lián)盟室間質(zhì)評(píng)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述；計(jì)數(shù)資料以“例(百分率，%)”描述，兩組間差異的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以最終臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)集菌法、MGIT 960培養(yǎng)、Xpert技術(shù)的檢測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率，并進(jìn)行一致性Kappa檢驗(yàn)。其中Kappa值判定標(biāo)準(zhǔn)為：0

結(jié) 果

一、患者確診情況

98例患者中，54例(55.1%)確診為腸結(jié)核，其中男性42例(77.8%)、女性12例(22.2%)；年齡范圍為13～86歲，中位年齡[M(Q1,Q3)]為35(27，60)歲；16例(29.6%)經(jīng)糞便分枝桿菌培養(yǎng)陽性確診，38例(70.4%)以臨床表現(xiàn)、腸鏡檢查結(jié)果、抗結(jié)核治療有效等臨床綜合診斷確診。44例(44.9%)確診為非腸結(jié)核，包括克羅恩2例、急性血行播散性肺結(jié)核6例、結(jié)核性腹膜炎7例、腸梗阻3例、惡性腫瘤3例、結(jié)核性胸膜炎7例、繼發(fā)性肺結(jié)核13例、非結(jié)核分枝桿菌1例、泌尿系結(jié)核2例；其中男性26例(59.1%)、女性18例(40.9%)，年齡范圍為18～78歲，中位年齡為46(31，64)歲。

二、不同檢測方法診斷腸結(jié)核的檢測效能

98例疑似患者中，Xpert對(duì)腸結(jié)核的陽性檢出率[38.8%(38/98)]明顯高于集菌法[15.3%(15/98)]和MGIT 960培養(yǎng)[16.3%(16/98)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.496，P=0.000；χ2=20.224，P=0.000)。其中，集菌法與MGIT 960培養(yǎng)同時(shí)陽性者9例，與Xpert同時(shí)陽性者16例，MGIT 960培養(yǎng)與Xpert同為陽性者15例。另外，Xpert對(duì)集菌法和(或)MGIT 960培養(yǎng)均陽性的54例腸結(jié)核患者糞便樣本的陽性檢出率為95.5%(21/22)，對(duì)二者均陰性糞便樣本的陽性檢出率為53.1%(17/32)。

以臨床確診患者為參照標(biāo)準(zhǔn)，集菌法、MGIT 960培養(yǎng)、Xpert對(duì)腸結(jié)核的檢測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率和Kappa值見表1。

表1 不同檢測方法以臨床確診為參照對(duì)腸結(jié)核診斷效能

討 論

腸結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染人體腸管而引發(fā)的慢性特異性感染性疾病，在發(fā)展中國家的患病率很高，也是我國重要的公共衛(wèi)生問題[10]。腸結(jié)核在成年人中常見，由于腸結(jié)核早期多缺乏特異性臨床表現(xiàn)，常導(dǎo)致診斷延誤、誤診誤治，增加不必要的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，也增加了患者死亡率[11]。雖然傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法一直是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于存在各自局限，臨床仍在尋求一種新的快速、準(zhǔn)確且高敏感度和高特異度的檢測方法。Xpert作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值已被多項(xiàng)研究評(píng)估[12-20]，認(rèn)為其在肺外標(biāo)本如胸腔積液、腦脊液、骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標(biāo)本及尿液等的檢測中均具有較高的敏感度，且檢測方法優(yōu)越，被認(rèn)為是可用于肺外結(jié)核各種類型臨床標(biāo)本(如腦脊液和組織樣本)的確證性診斷方法，但對(duì)于糞便標(biāo)本檢測效果的數(shù)據(jù)還較少。

本研究中，Xpert對(duì)腸結(jié)核的陽性檢出率明顯高于集菌法和MGIT 960培養(yǎng)，且對(duì)腸結(jié)核患者細(xì)菌學(xué)陽性糞便樣本(即涂片和/或培養(yǎng)陽性)的陽性檢出率為95.5%，對(duì)細(xì)菌學(xué)陰性(即涂片和培養(yǎng)均陰性)患者的陽性檢出率為53.1%，這些均表明Xpert技術(shù)在腸結(jié)核診斷中具有明顯優(yōu)勢。2018年，Rahman等[21]以培養(yǎng)為診斷標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了糞便標(biāo)本抗酸桿菌涂片、L-J固體培養(yǎng)法和Xpert三種檢測方法在肺結(jié)核中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)三者敏感度分別為53.9%、35.3%和90.2%，特異度均為100.0%。而熊瑜等[22]以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)比較了糞便標(biāo)本抗酸桿菌涂片、MGIT 960培養(yǎng)和Xpert三種檢測方法，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)腸結(jié)核的診斷敏感度分別為13.2%、43.2%和60.4%，特異度分別為98.3%、100.0%和100.0%。本研究也以臨床最終診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)比較了糞便標(biāo)本集菌法、MGIT 960培養(yǎng)和Xpert檢測的敏感度、特異度和Kappa值，發(fā)現(xiàn)Xpert檢測糞便標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度(70.4%)明顯高于其他兩項(xiàng)方法(分別為27.8%和29.6%)，且具有較好的一致性(Kappa值為0.60)，提示Xpert檢測敏感度明顯高于培養(yǎng)和涂片法，且與臨床診斷中、高度一致，與上述研究結(jié)果基本一致。雖然相關(guān)數(shù)據(jù)有差異，但可能與參考標(biāo)準(zhǔn)、患者類型、檢測操作方法不同有關(guān)。MacLean等[23]進(jìn)行了一項(xiàng)糞便Xpert診斷兒童結(jié)核病準(zhǔn)確性的系統(tǒng)綜述和薈萃分析，結(jié)果表明，相較于微生物學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)，糞便Xpert檢測的綜合敏感度和特異度分別為67%和99%，也符合本研究結(jié)果范圍，說明Xpert檢測糞便標(biāo)本能夠更好地輔助臨床診斷。尤其是近幾年在兒童、無痰或少痰及免疫功能低下患者中對(duì)疑似結(jié)核病患者進(jìn)行了多項(xiàng)研究，期望能用糞便標(biāo)本替代其他樣本進(jìn)行檢測診斷，同時(shí)也對(duì)糞便樣本的處理方式進(jìn)行了探索，認(rèn)為糞便樣本有效處理技術(shù)對(duì)Xpert成功檢測成人或兒童糞便標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌是非常有效的[21，23-26]，對(duì)于消除PCR抑制劑和獲得有效結(jié)果至關(guān)重要，認(rèn)為Xpert檢測糞便的方法可能對(duì)于評(píng)估無痰或留樣不便利疑似患者的檢測價(jià)值更有前途，對(duì)提高結(jié)核病快速診斷和治療意義重大。

本研究中，MGIT 960培養(yǎng)的敏感度較其他文獻(xiàn)報(bào)道偏低[21，23]，認(rèn)為可能原因?yàn)椋菏紫?，MGIT 960培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求極高，實(shí)驗(yàn)前處理過程較為復(fù)雜，在前處理過程中損耗掉了一部分菌量，本研究糞便標(biāo)本在處理過程中所用的消化條件與痰液相同，使糞便標(biāo)本中的大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌暴露于堿性環(huán)境中，也會(huì)使一部分結(jié)核分枝桿菌被殺死而失去活性，且加樣量僅有500 μl，載菌量較低，從而也降低了MGIT 960培養(yǎng)的陽性檢出率；其次，本研究中大多數(shù)腸結(jié)核患者在留取標(biāo)本之前已經(jīng)在當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病機(jī)構(gòu)進(jìn)行了一段時(shí)間的抗結(jié)核藥物治療，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)主要針對(duì)檢測的是活的結(jié)核分枝桿菌，可能受抗結(jié)核治療的影響較大，而Xpert主要檢測的是結(jié)核分枝桿菌DNA，不能區(qū)分死菌和活菌，對(duì)其陽性檢出率影響不大；再次，由于腸結(jié)核患者的特殊性，難以確定留取糞便標(biāo)本時(shí)間，也有可能降低陽性檢出率。但偏低的MGIT 960培養(yǎng)陽性檢出率并不會(huì)影響Xpert較高的陽性檢出率，而且Xpert相較于其他兩種方法，還具有檢測時(shí)間短、可直接檢測患者標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌及利福平是否耐藥等優(yōu)點(diǎn)，更有利于腸結(jié)核的早期診斷。

本研究也有一定局限：一是本研究雖然統(tǒng)計(jì)了近3年疑似腸結(jié)核患者糞便樣本的檢測情況，但因同時(shí)進(jìn)行集菌法、MGIT 960培養(yǎng)和Xpert檢測的患者數(shù)只有98例，樣本量較少，未對(duì)其是否有過抗結(jié)核治療等予以排除，可能會(huì)影響MGIT 960培養(yǎng)的陽性檢出率；二是由于實(shí)驗(yàn)室檢測條件有限，對(duì)于MGIT 960培養(yǎng)與Xpert檢測不相符的結(jié)果未能進(jìn)一步進(jìn)行基因測序驗(yàn)證；三是研究未對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行藥物敏感性分析，這也將是下一步研究的重點(diǎn)；四是Xpert檢測糞便標(biāo)本陽性并不代表可確診腸結(jié)核，也有可能是肺結(jié)核患者吞咽了含有結(jié)核分枝桿菌的痰液[27]，這需要臨床謹(jǐn)慎排查。雖然本研究有很多局限性，但由于目前診斷腸結(jié)核依賴于腸黏膜組織標(biāo)本的培養(yǎng)，常因菌量少而難以檢出，也易造成假陰性，故高敏感度和高特異度的糞便Xpert檢測為臨床診斷腸結(jié)核拓展了新思路，也有利于腸結(jié)核的早期診斷，認(rèn)為將之與臨床和常規(guī)檢測相結(jié)合是值得臨床嘗試的新方法。

綜上所述，Xpert檢測糞便標(biāo)本對(duì)腸結(jié)核早期診斷具有較高的敏感度和特異度，且高于傳統(tǒng)的集菌法和培養(yǎng)法，能更好地輔助臨床診斷；而且非侵入性的收集方式也極大地減輕了那些不便于留取組織樣本患者的痛苦，降低了結(jié)腸鏡檢查獲取組織進(jìn)行細(xì)菌學(xué)診斷的經(jīng)濟(jì)壓力，并明顯縮短了診斷時(shí)間，因此，對(duì)臨床疑似腸結(jié)核患者，可優(yōu)先選擇Xpert檢測糞便樣本，對(duì)早診斷、早治療及預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥有一定臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)李靜：實(shí)施研究，起草文章；梁亞萍和鄒遠(yuǎn)嫵：分析/解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；張思琪：采集整理數(shù)據(jù)；鄭見寶：英文翻譯，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、指導(dǎo)；仵倩紅：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政支持