張 雪，吾布里塔里甫·達(dá)吾提，畢曉娟，呂國(guó)棟，楊 寧，林仁勇，4

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 2公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830017；3新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院，4省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054)

世界衛(wèi)生組織已將棘球蚴病(俗稱(chēng)包蟲(chóng)病)列為截至到2050年控制或消除的17種被忽視疾病之一[1-2]。人囊性棘球蚴病(CE)和肺泡性棘球蚴病(AE)是最常見(jiàn)的兩種亞型，分別由細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴的幼蟲(chóng)期引起。AE呈癌樣浸潤(rùn)生長(zhǎng)。如果未經(jīng)治療或處理不當(dāng)，AE在最初診斷后15年內(nèi)的死亡率可達(dá)90%[3]。AE囊腫能在人宿主的肝組織中長(zhǎng)期存活，常引起慢性感染，對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生有重要影響，并逐漸形成由各種浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成的免疫微環(huán)境[4]。棘球蚴病慢性感染期細(xì)胞因子的表達(dá)，在寄生蟲(chóng)免疫耐受和逃避過(guò)程中起著關(guān)鍵的指示作用。因此，闡明慢性感染模式的細(xì)胞因子譜對(duì)于解釋棘球蚴病感染期間免疫應(yīng)答受損背后的一些機(jī)制至關(guān)重要。本研究通過(guò)流式微珠陣列技術(shù)(Cytometric beads array,CBA)[5]對(duì)不同階段棘球蚴感染患者血清進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)患者外周血中不同免疫細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子進(jìn)行相關(guān)性及差異性分析，同時(shí)結(jié)合臨床資料及血清學(xué)指標(biāo)，以期能夠?yàn)榕R床及隨訪中用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的免疫學(xué)識(shí)別標(biāo)志物及進(jìn)一步的免疫學(xué)治療提供有用的信息。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象2020年8月-2021年2月，收集在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療的20例AE患者(平均年齡46.6歲，男性7例，女性13例)信息及臨床資料，獲取同一患者AE術(shù)前及AE術(shù)后的外周血標(biāo)本，同期來(lái)自同一醫(yī)院的20例健康體檢人員(平均年齡42.9歲，男性10例，女性10例)作為正常對(duì)照組并獲取正常對(duì)照組外周血標(biāo)本，兩組均衡可比。本研究過(guò)程均遵循新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)有關(guān)人體試驗(yàn)的相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并獲得所有入選對(duì)象的知情同意并簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合 WS257-2006《包蟲(chóng)病診斷標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)AE的診斷；(2)患者均經(jīng)影像學(xué)證實(shí)并接受醫(yī)學(xué)隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)與急性疾病(非AE)和妊娠相關(guān)；(2)服用除阿苯達(dá)唑外的任何抗炎藥、免疫抑制劑和抗寄生蟲(chóng)藥。

1.2儀器及試劑AriaII流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；流式微珠陣列技術(shù)(Cytometric beads array,CBA)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(Biolegend公司)。

1.3方法

1.3.1 標(biāo)本留存 將正常對(duì)照組、術(shù)前、術(shù)6個(gè)月后的AE患者，常規(guī)采血管(非抗凝)抽取血液2 mL，靜置30 min待標(biāo)本凝固,1 500 r/min離心10 min，分離血清，注意剔除溶血標(biāo)本，將血清分裝于凍存管中-80度保存。

1.3.2 標(biāo)本預(yù)處理 將標(biāo)本及CBA試劑盒恢復(fù)至室溫，7支聚丙烯離心管分別標(biāo)注為C7-C1，6支試管中每支加入75 μL的檢測(cè)緩沖液。將25 μL的最高標(biāo)準(zhǔn)品C7轉(zhuǎn)移到C6管中，制備1∶4稀釋后的最高標(biāo)準(zhǔn)品，依次倍比稀釋?zhuān)@得標(biāo)準(zhǔn)品；血清標(biāo)本用檢測(cè)緩沖液稀釋2倍；將預(yù)混合的Beads在超聲波浴中超聲1 min，然后旋渦30 s，使Beads完全重懸，各取25 μL加入含有Assay Buffer的各樣本管中，加入血清標(biāo)本25 μL，避光室溫下震蕩孵育2 h；每管加入檢測(cè)抗體25 μL，避光室溫下以大約500 r/min的速度搖床搖1 h；每孔直接加入25 μL藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，孵育30 min，緩沖液清洗，加入150 μL洗滌緩沖液重懸，待測(cè)。

1.3.3 儀器準(zhǔn)備 在數(shù)據(jù)采集前設(shè)置好流式細(xì)胞儀。創(chuàng)建模板，用CBA試劑盒單色[6]熒光試劑調(diào)整電壓補(bǔ)償，在分析前渦旋每個(gè)標(biāo)本5 s，將流速設(shè)置為“低”；設(shè)置每個(gè)分析物需要采集的微粒數(shù)為300。創(chuàng)建一個(gè)包含微粒A和微粒B的大型門(mén)，這將排除大部分碎片；設(shè)置完成，上機(jī)檢測(cè)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)的血清13種細(xì)胞因子包括：Th1型[干擾素-γ(Interferon gamma，IFN-γ)、干擾素-α2(Interferon-α2，IFN-α2)、白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)]；Th2型[白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)、白細(xì)胞介素-33(Interleukin-33，IL-33) 、白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)]；Th17型[白細(xì)胞介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)、白細(xì)胞介素-23(Interleukin-23，IL-23)]；炎性因子[白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)]；趨化因子[單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)]。

2 結(jié)果

2.13組血清細(xì)胞因子水平比較與正常對(duì)照組比較，AE術(shù)前血清中Th1Th2型細(xì)胞因子白介素IFN-α2、IL-12、IL-6和IL-33、IL-18、IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Th17型細(xì)胞因子IL-17A、IL-23水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與AE術(shù)前比較，AE術(shù)后外周血中IL-10、IL-18水平較AE術(shù)前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ；IL-17A、IL-23水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),見(jiàn)表1、圖1。

表1 3組血清細(xì)胞因子水平比較

2.213種細(xì)胞因子之間的相關(guān)性使用R軟件計(jì)算13中細(xì)胞因子之間的相關(guān)性，構(gòu)建細(xì)胞因子之間的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，Th1 (IFN-α2，IL-12，IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子IL-33(r值分別為0.877、0.595、0.807)表現(xiàn)出密切的相關(guān)性，且IL-12與IFN-α2顯著相關(guān)(r值為0.772)；IL-17A和IL-12、IL-23和IFN-γ、IL-23和IL-12表現(xiàn)出密切的相關(guān)性(r值分別為0.621、0.548、0.613)；趨化因子IL-8與IL-17A及IFN-α2顯著相關(guān)(r值分別為0.533、0.548，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

2.3基于淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比率(LMR)的炎癥標(biāo)志物在AE手術(shù)前后的變化根據(jù)單變量分析，與AE術(shù)前比較，AE術(shù)后外周血中血小板計(jì)數(shù)，球蛋白含量、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比率較AE術(shù)前降低，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ；淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比率(LMR)與IFN-γ及Th17型(IL-17、IL-23)表達(dá)呈正相關(guān)(r值分別為0.808、0.488，P<0.001),見(jiàn)表2、圖3。

表2 AE術(shù)前術(shù)后血清學(xué)指標(biāo)比較

續(xù)表2：

3 討論

細(xì)胞因子幾乎涉及免疫和炎癥的每一個(gè)方面，從先天免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)到細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生和體液免疫抗體的產(chǎn)生[7]。免疫損傷時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子組合決定了免疫系統(tǒng)的哪一支將被激活，疾病的進(jìn)展和結(jié)局在一定程度上取決于感染時(shí)發(fā)生的免疫反應(yīng)的組成和類(lèi)型[8]，患者血清中細(xì)胞因子的變化可能與臨床干預(yù)后疾病的結(jié)局有關(guān)。因此，鑒定血清免疫標(biāo)記物來(lái)評(píng)價(jià)治療效果越來(lái)越受到關(guān)注。

周璇等[9]的研究表明，寄生蟲(chóng)及其分泌和/或排泄分子可能會(huì)啟動(dòng)一種適當(dāng)?shù)臉O化T輔助細(xì)胞(Th)反應(yīng)，使寄生蟲(chóng)能夠逃脫免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性攻擊，并在宿主[10]中存活。本研究結(jié)果顯示，AE患者術(shù)前血清中Th1(IFN-α2、IL-12)和Th17(IL-17A、IL-23)及 Th2(IL-6、IL-10、IL-33、IL-18)細(xì)胞因子明顯高于正常對(duì)照組；且Th1(IFN-α2、IL-12、IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子(IL-33)，Th17細(xì)胞因子(IL-17A、IL-23)和Th1(IL-12、IFN-γ)密切相關(guān)。

Th2占主導(dǎo)的細(xì)胞因子譜與感染性疾病的慢性分期、臨床并發(fā)癥和繼發(fā)性發(fā)作相關(guān)，其反應(yīng)有利于寄生蟲(chóng)的建立；而Th1與保護(hù)性免疫相關(guān)，其反應(yīng)對(duì)寄生蟲(chóng)是致命的[11]。然而，由于免疫調(diào)控因子的相互作用，實(shí)際情況復(fù)雜得多，因此，經(jīng)常出現(xiàn)Th1/Th2的混合反應(yīng)；同時(shí)，細(xì)胞因子反應(yīng)與AE患者疾病結(jié)局之間的相互作用亦尚不清楚。這就需要通過(guò)它們之間的相關(guān)性及差異性來(lái)進(jìn)一步評(píng)估疾病進(jìn)展及干預(yù)效果。本研究發(fā)現(xiàn)，Th2型細(xì)胞因子IL-33與Th1型細(xì)胞因子IFN-γ密切相關(guān)；IL-33通過(guò)在免疫偏置性寄生蟲(chóng)感染中的高表達(dá),激活Th2型輔助細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，從而支持宿主抵御寄生蟲(chóng)[12]，因而，IL-33與IFN-γ的相關(guān)性可能與寄生蟲(chóng)感染引起的免疫反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，同時(shí)提示AE患者發(fā)生了炎癥反應(yīng)。此外，Th1細(xì)胞通過(guò)IL-12激活TNF-α和IFN-α2[13]被建議在AE中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，與本研究結(jié)果一致，IL-12與IFN-α2 顯著相關(guān)，提示IL-12與IFN-α2之間關(guān)聯(lián)關(guān)系的改變，能夠作為寄生蟲(chóng)在人類(lèi)宿主中發(fā)揮作用持久性的預(yù)測(cè)。由于Th17細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-17A、IL-23，參與AE過(guò)程中Th1/Th2細(xì)胞失衡的發(fā)生，在AE中對(duì)調(diào)控免疫耐受和組織炎癥起著微妙的作用[14-15]。在本研究中，Th17細(xì)胞因子(IL-17A、IL-23)和Th1 細(xì)胞因子(IL-12、IFN-γ)表現(xiàn)出密切的相關(guān)性，且IL-17A與趨化因子(IL-8)顯著相關(guān)，提示Th17細(xì)胞因子(IL-17A、IL-23)具有較高的中心性，在AE發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出不同的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。本研究還發(fā)現(xiàn)，AE患者術(shù)前IFN-α2、IL-12及IL-10水平較正常對(duì)照組明顯升高，且AE患者術(shù)后IL-10水平較術(shù)前高,揭示了IL-10對(duì)T輔助細(xì)胞亞群的廣泛調(diào)節(jié)功能，提示IL-10可能是評(píng)估治療有效性的潛在免疫標(biāo)志物。

炎癥在疾病進(jìn)展中扮演重要的角色，同時(shí)也參與宿主的免疫功能調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)單變量分析，將術(shù)前術(shù)后一般血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較，并結(jié)合細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與AE術(shù)前比較，AE術(shù)后外周血中血小板計(jì)數(shù)，淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比率(LMR)較AE術(shù)前降低，這一結(jié)果與炎癥因子IFN-γ及具有較高中心性的Th17型(IL-17、IL-23)表達(dá)規(guī)律一致且呈正相關(guān)。淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比率(LMR)是一種新的炎癥生物標(biāo)志物，作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后和指導(dǎo)治療的潛在標(biāo)記物，它們反映了炎癥微環(huán)境中局部免疫反應(yīng)和全身炎癥反應(yīng)(SIR)之間的復(fù)雜相互作用。外周血LMR越高，患者預(yù)后越差[16-17]。本研究的結(jié)果提示,AE患者的特殊細(xì)胞因子譜表達(dá)同時(shí)結(jié)合炎癥指標(biāo)，可作為評(píng)估抗寄生蟲(chóng)藥物/手術(shù)治療效果的重要生物標(biāo)志物，同時(shí)可對(duì)疾病的進(jìn)展階段給出提示。

綜上所述，對(duì)AE患者在不同感染狀態(tài)下細(xì)胞反應(yīng)譜的研究表明，不僅細(xì)胞因子，而且趨化因子均參與協(xié)調(diào)了疾病的進(jìn)展或/和消退。本研究基于流式微珠陣列技術(shù)，檢測(cè)了AE患者的13種細(xì)胞因子,通過(guò)結(jié)合臨床血清學(xué)指標(biāo)，初步揭示了免疫特性異常的關(guān)鍵細(xì)胞因子檢測(cè)在AE感染不同階段中的應(yīng)用價(jià)值，以期獲得有效的干預(yù)點(diǎn)，為免疫治療帶來(lái)新的契機(jī)。