劉 穎，詹凌波，王蕾，王新有，范文霞，孫明玲，趙冠云，郭新紅

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液病中心，新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所， 烏魯木齊 830054；2浙江大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，杭州 310012)

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的一種類型，具有高度侵襲性及異質性。一線方案化療后，仍有30%～40%的患者演變?yōu)閺桶l(fā)難治性DLBCL[1-4]。有無B組癥狀、國際預后指數(shù)(IPI)評分和β2-微球蛋白(β2-MG)水平是與DLBCL預后密切相關的重要標志物[1,5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能失調是DLBCL疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，免疫檢查點可通過免疫抑制性受體與配體的相互作用，激活一系列信號通路，下調T淋巴細胞的活性。程序性死亡受體-1(PD-1)和淋巴細胞活化基因-3(LAG-3)是兩種常見的免疫抑制受體，可以通過抑制效應T細胞的功能，從而促進腫瘤免疫逃逸。在多種實體腫瘤的微環(huán)境中，檢測到CD8+T淋巴細胞上PD-1、LAG-3的高表達[7-9]，Yang等[10]在濾泡性淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境(TME)中腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)上高表達PD-1、LAG-3，且LAG-3與PD-1有協(xié)同作用，共同影響CD8+T淋巴細胞的功能。這預示著PD-1、LAG-3高表達可能與腫瘤進展及患者不良預后相關。

本研究通過檢測DLBCL患者外周血CD8+T細胞上PD-1、LAG-3的表達水平，分析其與患者B癥狀、IPI評分及β2-MG水平的關系，并探討PD-1、LAG-3的表達對DLBCL患者外周血CD8+T細胞功能的影響及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象本研究共選取2019年8月至2020年12月于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液病中心住院的17例初治DLBCL患者為病例組，選取同時期10例年齡、性別相匹配的健康體檢者為對照組。病例組中男性11例(64.7%)，女性6例(35.3%)，患者中位年齡64歲(38～83歲)。所有患者均診斷為DLBCL，起病時IPI(<3分)為低危/低中危組6例，IPI(≥3分)為中危組/高危組11例。11例使用R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、表阿霉素、長春新堿、強的松)方案化療，6例使用R-CDOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、脂質體阿霉素、長春新堿、強的松)方案化療。六療程治療后的DLBCL患者采用2014年版的Lugano標準[11]進行臨床療效評估，其中7例DLBCL患者完成評估，11例患者失訪，7例完成評估的患者中，5例(71.4%)患者完全緩解(CR)，1例(14.3%)患者為部分緩解(PR)，1例(14.3%)患者為疾病穩(wěn)定(SD)。

1.2納入與排除標準納入標準：(1)病理診斷符合2016年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類診斷標準，且均經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科通過形態(tài)學及免疫組織化學方法確診為DLBCL；(2)具有較完整的臨床資料及完整的治療情況記錄與隨訪結果；(3)初次發(fā)病，既往未接受過任何放化療等治療。健康對照組10例，均為本地區(qū)健康體檢者，并通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，告知本試驗的目的和意義，所有患者與健康對照均簽署知情同意書。排除標準：(1)資料不全及失訪者；(2)有其他腫瘤、免疫缺陷性疾病、感染性疾病等伴發(fā)疾病者。

1.3方法

1.3.1 標本采集 無菌采集DLBCL患者治療前后及正常對照組清晨空腹外周血5 mL，使用肝素鈉抗凝，以上標本均經2 000 r/min離心10 min，吸取上清液于EP管中，將剩下的全血加入等量PBS吹打混勻，再輕輕注入淋巴細胞分離液(購自BD Biosciences公司)中，2 000 r/min離心20 min，此時離心管中由上至下分為4層，分別為血漿層、乳白色淋巴細胞層、透明分離液層、紅細胞層，用巴氏管輕輕收集淋巴細胞層，加入4 mL PBS與其充分混勻，1 000 r/min離心5 min，洗滌2次即得所需淋巴細胞。

1.3.2 流式細胞術檢測外周血CD8+T細胞表面LAG-3、PD-1表達水平 將分離好的DLBCL患者及正常對照組淋巴細胞分別置入兩支流式管中，再向流式管中分別加入CD3-PerCP、CD8-FITC、LAG-3-APC、PD-1-PE各10 μL，混勻后室溫避光15 min，用PBS洗滌2次，重懸細胞后，使用流式細胞儀進行檢測，分析PD-1+LAG-3-CD8+T細胞、PD-1-LAG-3+CD8+T細胞、PD-1+LAG-3+CD8+T細胞、PD-1-LAG-3-CD8+T細胞的表達情況。

2 結果

2.1病例組與對照組CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例比較與對照組相比，病例組PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細胞比例較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；與正常對照組相比，DLBCL患者組PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 病例組與對照組CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例比較

2.2病例組治療前后CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例比較病例組經治療后PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細胞比例均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。病例組治療前后PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。病例組治療前后及對照組CD8+T細胞上PD-1、LAG-3的表達趨勢如圖1。

表2 病例組治療前后CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例比較

進一步選取病例組中7例未失訪的病例，將其治療前后PD-1、LAG-3的表達水平行配對t檢驗。經治療后病例組PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+及PD-1+LAG-3+CD8+T細胞比例均較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，治療前后PD-1-LAG-3-CD8+T細胞的比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 7例未失訪病例組患者治療前后CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例比較

2.3病例組CD8+T細胞PD-1、LAG-3的所占比例與各臨床指標之間的關系病例組中，起病時伴有B組癥狀的患者PD-1+LAG-3-CD8+T細胞比例較無B組癥狀的患者高，進一步行Point-biserial檢驗，PD-1+LAG-3-CD8+T細胞比例與DLBCL患者B癥狀具有顯著相關性(r=0.598，P<0.05)，PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例與B癥狀無顯著相關性(P>0.05)；IPI≥3分患者與IPI<3分患者比較，PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；β2-MG≥ 2.2 mg/L的患者與β2-MG<2.2 mg/L的患者比較，PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞比例與患者的IPI評分、β2-MG水平均無顯著相關性(r=0.598，P>0.05)，見表4。

表4 病例組CD8+T細胞PD-1、LAG-3所占比例與各臨床指標之間的關系

3 討論

DLBCL作為一種高度異質性的侵襲性淋巴瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且治療反應及預后差異性較大，目前隨著對DLBCL研究的逐漸深入，腫瘤免疫治療逐漸成為DLBCL治療的新手段。CD8+T淋巴細胞是TME中最重要的一類免疫細胞，是抑制或清除腫瘤細胞的主要力量。然而，由于T細胞負性共刺激分子的過表達，使得其殺傷腫瘤細胞的能力被不同程度削弱或耗盡，近年來，隨著對腫瘤免疫治療研究的逐漸深入，針對免疫抑制分子PD-1/PD-L1在惡性腫瘤治療中的研究已經取得顯著進展，然而，Ansell等[17]在研究納武利尤單抗(Nivolumab)對復發(fā)性/難治性DLBCL患者的研究中發(fā)現(xiàn)，使用Nivolumab單藥治療的有效率僅為10%左右；另一項對接受PD-1/PD-L1抑制劑治療晚期非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，納入的93例患者中，36例患者(38.7%)發(fā)生了原發(fā)性耐藥[18]。以上研究說明，使用免疫檢查點抑制劑單藥治療，由于存在耐藥現(xiàn)象、應答率低等缺點，仍使得一部分患者治療效果不理想。研究發(fā)現(xiàn)，另一些免疫檢查點如LAG-3與 PD-1/PD-L1通路阻斷的抵抗有關。在多種實體腫瘤(如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等)的微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞上LAG-3的高表達，并且其表達與PD-1+T細胞增加有關[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在初治DLBCL患者體內，PD-1+LAG-3-CD8+T、PD-1-LAG-3+CD8+T及PD-1+LAG-3+CD8+T細胞的比例均較對照組升高，治療后明顯下降。提示PD-1、LAG-3在DLBCL的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能是部分DLBCL患者的潛在生物標志物或治療靶點。Chen等[22]研究也發(fā)現(xiàn)DLBCL的腫瘤侵潤淋巴細胞(TIL)上存在PD-1、LAG-3高表達，并且PD-1+的TIL計數(shù)與LAG-3+TIL計數(shù)之間呈正相關。張小可等[23]在研究R-CHOP方案對DLBCL患者PD-1的影響時也發(fā)現(xiàn)，使用R-CHOP方案治療六療程后，DLBCL患者PD-1表達水平較治療前明顯降低。

DLBCL是成人發(fā)病率最高的淋巴瘤類型，臨床上伴有B組癥狀、血清β2-MG水平升高及IPI評分≥3分均被認為是DLBCL預后不良的重要因素。本研究進一步分析病例組CD8+T細胞PD-1、LAG-3的表達水平與各臨床指標之間的關系發(fā)現(xiàn)，伴有B癥狀的DLBCL患者組較無B癥狀患者組相比，PD-1+LAG-3-CD8+T細胞比例較高，PD-1+LAG-3-CD8+T細胞比例與DLBCL患者B癥狀具有顯著相關性，PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞的比例，與DLBCL患者B癥狀無顯著相關性。

PD-1+LAG-3-、PD-1-LAG-3+、PD-1+LAG-3+及PD-1-LAG-3-CD8+T細胞的比例與患者的IPI評分、β2-MG水平均無顯著相關性。錢素英等[15]的研究顯示，與正常淋巴組織相比，DLBCL患者CD8+T細胞上PD-1的表達較高，且與IPI評分呈正相關；劉笑吟等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1、LAG-3、TIM-3共表達與較高的IPI評分相關，而PD-1、LAG-3單獨陽性表達與多種臨床指標之間的比較均無統(tǒng)計學意義。另一項關于外周T細胞淋巴瘤的研究顯示，PD-1的陽性表達率在不同IPI評分、有無B癥狀之間差異無統(tǒng)計學意義[25]。Fang等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在IPI評分<3分、無B癥狀的DLBCL患者TIL上表達較高。Kiyasu等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)，在DLBCL患者TIL上PD-1的表達在無B癥狀患者體內更高，以上研究結果與本試驗結果所得結論存在差異，原因可能是本實驗所檢測的是DLBCL患者外周血CD8+T細胞上PD-1、LAG-3的水平，而PD-1、LAG-3存在于腫瘤微環(huán)境的多種免疫細胞上，不同細胞亞群上上述免疫抑制分子的表達水平及臨床意義可能不盡相同，且本試驗為單中心研究，樣本量較少，治療后部分患者療效未達到CR，今后可擴大樣本量以減少其他因素對結果的影響。

綜上所述，本研究探討了DLBCL患者CD8+T細胞上PD-1、LAG-3的表達水平與健康人之間的差異，以及治療前后表達水平的變化，并進一步分析了免疫抑制分子PD-1的表達水平與DLBCL患者B癥狀之間的相關性，提示其可能與DLBCL患者的腫瘤負荷及預后存在一定關系。目前對于DLBCL患者免疫檢查點PD-1、LAG-3通路及臨床意義方面的研究相對較少，PD-1、LAG-3是否能夠作為DLBCL患者的潛在治療靶點尚需進一步研究。