張 冰，王 超，陳鵬麗，何畢晨，努爾比亞·艾力，陳煜乾，閆 睿

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，2新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊830011)

丙泊酚作為一種臨床常用的短效靜脈麻醉藥[1]，可能是通過(guò)激活GABA受體，干擾興奮性、抑制性突觸傳遞效能，參與中樞抑制效應(yīng)，從而產(chǎn)生全身麻醉作用[2]。然而，除了作為理想麻醉藥物外，越來(lái)越多的證據(jù)表明長(zhǎng)期反復(fù)使用可產(chǎn)生精神依賴性，其機(jī)制尚不明確。研究表明，中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)起源于腹側(cè)被蓋區(qū)(Ventral tegmental area，VTA)，與伏隔核(Nucleus accumbens，NAc)、海馬體相連，是獎(jiǎng)賞和成癮的重要組成部分，所有濫用藥物都會(huì)激活該通路使得中樞多巴胺(Dopareine，DA)含量增加[3]。GABA (γ-aminobutyric acid)在VTA的高表達(dá)已經(jīng)證實(shí)，并且在VTA內(nèi)微量注射GABA受體激動(dòng)劑巴氯芬可減少海洛因攝入，并使NAc中DA的釋放降低[4]。腺苷作為一種中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)，其受體亞型A2A受體在藥物成癮中起著重要的作用，對(duì)DA的調(diào)控作用尚存爭(zhēng)議[5]。本研究擬驗(yàn)證丙泊酚是否可以通過(guò)A2AR調(diào)控VTA中GABA，繼而影響DA的釋放(A2A-GABA-DA通路)，產(chǎn)生精神依賴。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重(250±50)g，周齡(7±1) w，大鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)在恒溫、恒定濕度的環(huán)境中，自由飲食。

1.2主要試劑與儀器位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)設(shè)備(北京眾實(shí)科技有限公司，ZS-CPP)， 腦立體定位儀器(北京眾實(shí)科技有限公司，型號(hào)：ZS-FD)，臺(tái)式離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器制造廠，Neofuge)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad,電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP-9272)，微量振蕩器(壇市醫(yī)療儀器廠，MM-2)，GABA試劑盒(南京建成股份有限公司)，DA試劑盒(華美生物股份有限公司)，山羊抗兔IgG H&L、山羊抗小鼠IgG H&L購(gòu)自Abcam?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，Chemiscope 3000), 腺苷A2A受體拮抗劑DMPX、高選擇性A2A受體激動(dòng)劑CGS-21680均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物分組將48只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為：丙泊酚精神依賴+中樞注射腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS-21680組(Ic-CGS組)、丙泊酚精神依賴+中樞注射腺苷A2A受體拮抗劑DMPX組(Ic-DMPX組)、丙泊酚精神依賴+中樞注射空白溶劑組(Ic-C組)、丙泊酚精神依賴+外周注射腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS-21680組(Ip-CGS組)、丙泊酚精神依賴+外周注射空白溶劑組(Ip-C組)、丙泊酚精神依賴+外周注射腺苷A2A受體拮抗劑DMPX組(Ip-DMPX組)。

1.4給藥方式

1.4.1 中樞途徑 顱內(nèi)給藥系統(tǒng)置入：術(shù)前禁食8 h，自由飲水，10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，無(wú)疼痛刺激反應(yīng)后開(kāi)始手術(shù)。大鼠頭部備皮，將其固定于校驗(yàn)后的腦立體定位儀器上，消毒，沿正中先切開(kāi)頭皮約1 cm，分離頭皮組織，標(biāo)記囟門(mén)。用腦定位儀測(cè)到前囟前1.28 mm和2.16 mm處并做標(biāo)記，兩點(diǎn)之間即為伏隔核所在區(qū)域[6]。選取一點(diǎn)并作標(biāo)記，顱骨鉆將顱骨鉆通而不損傷腦組織。將定制的長(zhǎng)度統(tǒng)一為2.6 mm的導(dǎo)管進(jìn)孔置入顱內(nèi)，和兩顆植入顱骨的不銹鋼螺釘固定。切口縫合，術(shù)后3 d腹腔注射抗生素。中樞藥物劑量：Ic-C組：0.5 μL、Ic-CGS組：2.5 ng/0.5 μL[7]，Ic-DMPX組：50 ng/0.5 μL[7]。

1.4.2 外周途徑 經(jīng)腹腔內(nèi)注射藥物劑量：Ip-C組：0.1 mL、Ip-CGS組：0.1 mg/kg[8]，Ip-DMPX組：0.25 mg/kg[9]。

1.5模型建立條件性位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)(Conditioned place preference，CPP)是目前公認(rèn)為評(píng)價(jià)藥物精神依賴性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚10]。試驗(yàn)箱由三種顏色和觸感都不同的三個(gè)小室組成，視頻追蹤分析系統(tǒng)記錄大鼠觀察期間內(nèi)的一切活動(dòng)，如活動(dòng)距離、在不同小室停留的時(shí)間、抓撓次數(shù)等等。此實(shí)驗(yàn)方法是在巴甫洛夫?qū)W習(xí)背景下建立的，把藥物與某個(gè)特定的非獎(jiǎng)賞性條件刺激(即背景不同的小室)反復(fù)練習(xí)之后，后者便可獲得獎(jiǎng)賞特性。反復(fù)幾次將動(dòng)物給藥后放在一個(gè)特定的環(huán)境中，如藥物具有獎(jiǎng)賞效應(yīng)，則特定環(huán)境就具有了獎(jiǎng)賞效應(yīng)的特性，動(dòng)物在不給藥的情況下依然表現(xiàn)出對(duì)該特定環(huán)境的偏愛(ài)，表現(xiàn)為在藥物配對(duì)小室中的活動(dòng)時(shí)間增加。建模成功指標(biāo)：丙泊酚精神依賴模型建立如之前研究所述相同[11]。判斷大鼠精神依賴模型是否成功建立的依據(jù)是CPP值，即伴藥側(cè)-非伴藥側(cè)大鼠花費(fèi)的時(shí)間。

1.6藥物干預(yù)及CPP值測(cè)定激動(dòng)劑組、空白溶劑組：適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，測(cè)造模前CPP值(造模前CPP值)，確定伴藥側(cè)及非伴藥側(cè)，經(jīng)過(guò)14 d造模后，第15天測(cè)造模后CPP值(造模后CPP值)，第16天予以腺苷A2A受體激動(dòng)劑或生理鹽水，15 min后再次測(cè)CPP值(干預(yù)后CPP值)。拮抗劑組：適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，測(cè)基礎(chǔ)CPP值， 14 d造模過(guò)程中，偶數(shù)天予以丙泊酚前20 min注射拮抗劑，第15天測(cè)造模后CPP值。

1.7標(biāo)本采集行為學(xué)結(jié)果測(cè)試完成后，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后處死，大鼠斷頭處理，用鑷子去骨瓣暴露腦組織，腦組織完整取下放入生理鹽水中清洗干凈，按照《大鼠腦立體定位圖譜》[6]，在一側(cè)腦半球距中線1 mm和3 mm處做矢狀切面，厚度為2 mm，將切下的腦片平放在載玻片上，按圖譜上位置辨認(rèn)腹側(cè)被蓋區(qū)及海馬組織，手術(shù)刀分離，置入無(wú)酶凍存管中放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。用ELISA檢測(cè)海馬中DA及腹側(cè)被蓋區(qū)GABA含量，Western Blot法檢測(cè)腹側(cè)被蓋區(qū)A2A受體表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)CPP值與造模前相比，Ic-C組造模后CPP值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明造模成功；予以空白溶劑干預(yù)后，與造模后相比，CPP值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見(jiàn)，空白溶劑無(wú)法改變大鼠的位置偏愛(ài)結(jié)果。與造模前相比，Ip-C組造模后CPP值升高(P<0.05),與造模后相比，Ip-C組干預(yù)后CPP值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與造模前相比，Ic-CGS組、Ip-CGS組造模后CPP值均明顯升高(P<0.05)，即造模成功；在予以激動(dòng)劑干預(yù)后，與造模后相比，兩組CPP值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即腺苷受體激動(dòng)劑在丙泊酚精神依賴建立的過(guò)程中有促進(jìn)精神依賴產(chǎn)生的作用。予以拮抗劑的Ic-DMPX組，Ip-DMPX組造模前后CPP值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由于拮抗劑是在模型建立過(guò)程中就會(huì)注射在大鼠體內(nèi)，故造模后即為干預(yù)后，如圖1。

2.2實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)與Ic-C組相比，丙泊酚精神依賴大鼠經(jīng)CGS-21680處理后，腹側(cè)被蓋區(qū)A2AR的表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，經(jīng)DMPX處理后表達(dá)降低(P<0.05)。 與Ip-C組相比，Ip-CGS組 A2AR表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ip-DMPX組表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。與Ic-C組相比， Ic-CGS組海馬組織DA含量增加(P<0.05)，Ic-DMPX組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Ip-C組相比，Ip-CGS組海馬組織DA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ip-DMPX組DA含量明顯降低(P<0.05)。相較于Ic-C組，Ic-CGS組腹側(cè)被蓋區(qū)GABA的含量明顯降低(P<0.05)，Ic-DMPX組GABA含量升高(P<0.05)；Ip-C、Ip-CGS、Ip-DMPX三組之間GABA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 大鼠腹側(cè)被蓋區(qū)中A2AR蛋白表達(dá)水平

表2 大鼠海馬中DA及腹側(cè)被蓋區(qū)中GABA的含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)精神依賴模型采用的條件性位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)，是目前公認(rèn)為評(píng)價(jià)藥物精神依賴性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]，造模成功率為88.9%[12]。因藥物在體內(nèi)多種代謝酶的作用下，化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，為保證所用干預(yù)劑確實(shí)在中樞中發(fā)揮作用，本研究設(shè)置兩種給藥方式：一是經(jīng)腹腔注射外周給藥，二是在大鼠顱頂置入導(dǎo)管，經(jīng)導(dǎo)管確切給藥至中樞伏隔核。選取腺苷A2A受體拮抗劑DMPX，高選擇性A2A受體激動(dòng)劑CGS-21680。在丙泊酚精神依賴大鼠中觀察腺苷受體調(diào)節(jié)劑對(duì)腹側(cè)被蓋區(qū)GABA和海馬DA的影響。

本研究行為學(xué)結(jié)果顯示，在已形成丙泊酚精神依賴大鼠的體內(nèi)注射A2AR激動(dòng)劑，會(huì)增強(qiáng)丙泊酚精神依賴大鼠的激勵(lì)作用。然而在模型建立過(guò)程中，在每次注射丙泊酚前20 min向大鼠體內(nèi)注射A2AR拮抗劑，行為學(xué)表現(xiàn)與造模前相同，提示A2AR拮抗劑可以抑制大鼠發(fā)生丙泊酚精神依賴。

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是外周還是中樞注射A2AR激動(dòng)劑對(duì)丙泊酚精神依賴大鼠VTA的A2AR的表達(dá)都無(wú)影響，與行為學(xué)結(jié)果一致，長(zhǎng)期注射A2AR的拮抗劑則可以降低該區(qū)域A2AR的表達(dá)。除此之外，A2AR激動(dòng)劑確實(shí)可以增加海馬組織中DA抑制反獎(jiǎng)賞神經(jīng)遞質(zhì)GABA的水平(外周給藥途徑表現(xiàn)不明顯)，拮抗劑則可以阻止這種趨勢(shì)。

由此結(jié)果可見(jiàn)丙泊酚精神依賴的建立確實(shí)通過(guò)腺苷受體發(fā)揮作用，但是與既往大部分研究結(jié)果不同的是，腺苷在本研究中對(duì)丙泊酚精神依賴起著激勵(lì)的作用。而A2AR基因敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)酒精的依賴[9]，但減少了嗎啡自我給藥和條件性位置偏好[13]，提示A2AR在不同藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制可能不同。但通過(guò)觀察中腦邊緣系統(tǒng)的GABA、DA的改變，本研究發(fā)現(xiàn)與其他濫用藥物相同，丙泊酚成癮的最終機(jī)制都是通過(guò)抑制中腦GABA神經(jīng)元，促使獎(jiǎng)賞系統(tǒng)DA釋放[14]。同時(shí)丙泊酚亦是GABA受體的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，通過(guò)對(duì)鄰近中樞神經(jīng)元的GABA受體的正向調(diào)節(jié)，增加了VTA中DA神經(jīng)元的放電，突觸前GABA受體的激活導(dǎo)致GABA從GABA能神經(jīng)元釋放減少，隨后多巴胺增加[15]。

綜上所述，丙泊酚產(chǎn)生精神依賴的發(fā)生機(jī)制可能是通過(guò)A2A受體激活大腦腹側(cè)被蓋區(qū)突觸前膜GABA 受體導(dǎo)致GABA釋放減少，從而減弱了中腦邊緣系統(tǒng)對(duì)DA釋放的抑制(A2A-GABA-DA通路)，最終造成丙泊酚的精神依賴。未來(lái)本研究還將對(duì)DA、GABA的具體亞型進(jìn)行分析，在中腦邊緣系統(tǒng)前額葉皮質(zhì)、伏隔核等多處進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探討A2AR在丙泊酚精神依賴過(guò)程中的作用。