熊昊杰，申晨晨，馬 艷

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830017)

砷是廣泛分布于自然界的類金屬元素，流行病學(xué)調(diào)查、動物及體外實驗表明，砷具有神經(jīng)毒性。大腦作為砷中毒的靶器官之一，砷可以透過血腦或胎盤屏障在腦組織中蓄積，長期接觸會導(dǎo)致慢性砷中毒進而增加神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的風(fēng)險，由于神經(jīng)細胞對有毒物質(zhì)較為敏感且不易再生，使得砷對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性研究顯得尤為重要[1-4]。目前砷致神經(jīng)發(fā)育毒性的具體機制尚不明確，多集中在凋亡[5]、氧化應(yīng)激[6]、信號通路改變[7-8]等方面，而河馬(Hippo)信號通路中轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)分子的激活和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[9-10]。小鼠神經(jīng)干細胞(NE-4C細胞)是一種處于胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)細胞，是研究神經(jīng)發(fā)育毒性的常用細胞模型，因此本研究選用NE-4C細胞作為受試對象來探究亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力及YAP蛋白表達的影響，為進一步探索砷的神經(jīng)發(fā)育毒性機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑小鼠神經(jīng)干細胞(NE-4C細胞，廣州吉妮歐公司)；亞砷酸鈉(iAs3+，分析純，北京化學(xué)試劑三廠)；胎牛血清(美國Sigma公司)；MEM低糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、谷氨酰胺、PBS緩沖液(美國HyClone公司)；RIPA裂解液、細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶公司)；GAPDH單克隆抗體(北京博奧森公司，bs-2188R，稀釋比1∶1 000)；兔抗小鼠YAP單克隆抗體(美國CST公司，#14074，稀釋比1∶1 000)、兔抗小鼠P-YAP單克隆抗體(美國CST公司，#13 008，稀釋比1∶1 000)；二抗Anti-rabbit IgG-HRP(美國CST公司，#7074，稀釋比1∶40 000)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(日本TAKARA公司)；高速離心機(美國Sigma公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)；三色預(yù)染marker、PCR儀(美國ThermoFisher Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 NE-4C細胞用含10%胎牛血清的MEM(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，隔天換液，用0.5%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞開展后續(xù)實驗。藥物干預(yù)時間按照參考文獻及預(yù)實驗結(jié)果確定干預(yù)時長為48 h；實驗分組按照亞砷酸鈉干預(yù)細胞48 h的IC50=1.608 μmol/L分為0(對照組)、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L組。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 亞砷酸鈉干預(yù)后，于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化，并進行拍照。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞將細胞接種至96孔板中，每孔個數(shù)為3×103個，每組設(shè)置3個復(fù)孔，放入37℃培養(yǎng)箱過夜，細胞貼壁后給予不同濃度亞砷酸鈉干預(yù)48 h，之后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，酶標儀測定450 nm吸光度值。

1.2.4 Western Blot檢測YAP、P-YAP蛋白表達 染毒結(jié)束后，收集細胞于冰上裂解30 min后、4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量。蛋白變性后取20～30 μg進行上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次后進行顯影，采用Image J進行灰度值分析。

1.2.5 qRT-PCR檢測YAP下游靶基因mRNA表達 染毒結(jié)束后，收集細胞利用Trizol法提取細胞RNA，并測定樣品的濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Primer-Blast軟件設(shè)計合成Gapdh(上游：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA、下游：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC)、Gli2(上游：GCTCCACACACCCGCAACAC、下游：CTCAGCATCGTCACTTCGGTCAG)、Tead1(上游：GATGAGCGACTCGGCAGATAAGC、下游：TCCCACACGGCGGATAGATAGC)、Tead2(上游：GCCGTCGCAAGATCATCCTGTC、下游：AATATGGCTGGAGACCTGCTTTCG)的熒光定量PCR引物。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書建立熒光定量PCR反應(yīng)體系。進行實時熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達量。

擴增條件為95℃預(yù)變性30 s；PCR反應(yīng)95℃變性5 s，60℃ 34 s，各個基因的退火溫度不同(GAPDH60℃、Gli2 63℃、Tead1 63℃、Tead2 63℃)退火1 min，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次實驗，以GAPDH作為內(nèi)參，運用2-ΔΔCt法進行計算并分析各個基因的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1亞砷酸鈉對NE-4C細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)0 μmol/L組細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈梭形，界限清楚，細胞密度80%～90%，隨著亞砷酸鈉濃度增加細胞數(shù)目呈現(xiàn)下降，細胞形態(tài)發(fā)生變化，梭形“觸角”開始萎縮，細胞多以單個細胞形態(tài)存在，2.4、3.2 μmol/L組細胞失去原本的形態(tài)，上清液中漂浮細胞及細胞碎片增加，貼壁能力顯著下降，出現(xiàn)大面積死亡，見圖1。

2.2亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力的影響CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度亞砷酸鈉對NE-4C細胞增殖具有抑制作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，與0 μmol/L組比較，除0.4 μmol/L組外，其余各組細胞活力均下降,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力的影響

2.3亞砷酸鈉對NE-4C細胞YAP、P-YAP蛋白表達的影響Western Blot結(jié)果顯示，P-YAP蛋白表達水平下調(diào)，YAP蛋白表達水平上調(diào)。與0 μmol/L組比較，1.6、2.4、3.2 μmol/L組P-YAP蛋白表達水平下降，1.6、2.4、3.2 μmol/L組YAP蛋白表達水平升高，1.6、2.4、3.2 μmol/L組P-YAP/YAP相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

表2 亞砷酸鈉對NE-4C細胞YAP、P-YAP蛋白表達的影響

續(xù)表2：

2.4亞砷酸鈉對YAP下游靶基因mRNA表達的影響檢測YAP下游靶基因表達水平結(jié)果顯示，Gli2、Tead1、Tead2 mRNA表達水平隨亞砷酸鈉濃度的升高而升高，與0 μmol/L組比較，1.6、2.4、3.2 μmol/L組Gli2 mRNA表達水平升高，2.4、3.2 μmol/L組Tead1 mRNA表達水平升高，0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L組Tead2 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 亞砷酸鈉對YAP下游靶基因mRNA表達的影響

3 討論

砷是一種公認的具有遺傳毒性的環(huán)境污染物，研究表明砷具有神經(jīng)發(fā)育毒性，其可通過胎盤、血腦屏障進入腦組織中，對子代神經(jīng)發(fā)育、成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的損傷，砷暴露還可引起神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞等神經(jīng)細胞死亡[11-14]。王念等[3]研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露可引起大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)縮小、細胞間隙變寬和死細胞增多等顯著細胞形態(tài)學(xué)改變，同時砷可明顯降低PC12細胞的存活率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NE-4C細胞對亞砷酸鈉較為敏感，較低濃度亞砷酸鈉干預(yù)即可對細胞造成毒性損傷作用，隨亞砷酸鈉濃度的升高細胞形態(tài)改變，活力降低，存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

YAP是哺乳動物中Hippo信號通路的主要下游效應(yīng)分子，當Hippo信號通路激活時，YAP被上游激活轉(zhuǎn)變?yōu)镻-YAP，隨后與14-3-3蛋白結(jié)合而滯留在細胞質(zhì)中或經(jīng)泛素化后降解，無法發(fā)揮增殖的特性，當Hippo信號通路關(guān)閉或該通路核心成員缺失時會促進YAP/TAZ入核水平增加，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD等結(jié)合并誘導(dǎo)與細胞增殖、遷移相關(guān)基因的表達[14]。YAP和TAZ的作用主要是在TEAD1-4介導(dǎo)下進行，YAP/TAZ不可以與DNA直接結(jié)合，其只能作為TEAD1-4的轉(zhuǎn)錄共激活因子參與調(diào)控[15]，同時也有研究認為YAP和TAZ與其他幾個轉(zhuǎn)錄因子也有關(guān)聯(lián)，諸如膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2[16](Gli2)、TEA結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子 1(Tead1)、TEA結(jié)構(gòu)域家族轉(zhuǎn)錄因子 2(Tead2)等基因均可被與YAP/TAZ結(jié)合的TEAD轉(zhuǎn)錄激活。

本研究前期結(jié)果顯示雖然砷可上調(diào)Hippo信號通路的多個成分，包括SAV1、MOB1、P-LATS1，進而激活Hippo信號通路，然而在NE-4C細胞中該通路的激活不同于傳統(tǒng)Hippo信號通路，本研究中Hippo信號通路的激活并沒有抑制YAP的表達。YAP蛋白表達變化呈升高趨勢，P-YAP蛋白表達則明顯降低，基于磷酸化蛋白的特殊性，本研究對各組P-YAP/YAP的比值進行比較后發(fā)現(xiàn)，其相對表達水平呈下降趨勢，提示P-YAP在細胞質(zhì)中的表達下降，進而導(dǎo)致YAP入核水平增加，并上調(diào)下游的靶基因Gli2、Tead1、Tead2 mRNA的表達水平。Li等[17]對小鼠Hippo信號通路核心分子進行檢測時發(fā)現(xiàn)，亞砷酸鈉上調(diào)了Hippo信號通路中的多個蛋白的表達水平，而P-YAP的表達水平下降，考慮其原因是砷可能會誘導(dǎo)一種PP2A磷酸酶使P-YAP去磷酸化，從而使其從14-3-3蛋白中浸出，而14-3-3蛋白已知有助于P-YAP在細胞質(zhì)中被降解。最近另一項研究表明[18]，在Hippo信號通路失活情況下，YAP可作為一種壓力感受器，選擇性地消除受損肝細胞，即在細胞應(yīng)激的作用下，將細胞從增殖轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲?，這與本研究前期實驗結(jié)果相一致，在NE-4C細胞遭遇一定損傷情況下，YAP自身活化以清除那些受損細胞，即YAP蛋白表達水平雖然上調(diào)，但NE-4C細胞活力隨亞砷酸鈉濃度的增加而降低。此外，YAP蛋白表達水平增加提示YAP入核水平增加以激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，有研究發(fā)現(xiàn)，MST1/2、SAV1、MOB1A/B、LATS1/2核心分子缺失或YAP的過表達小鼠模型均表現(xiàn)出TEAD等靶基因表達水平升高、祖細胞增殖增加和組織過度生長的現(xiàn)象。Lu等[19]在人正常肝細胞(LX-2)細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，泮托拉唑(PPZ)可通過阻斷YAP表達來抑制Gli2 mRNA的表達，以上發(fā)現(xiàn)均支持YAP的激活可調(diào)控Gli2、Tead1、Tead2等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，亞砷酸鈉可能通過其他途徑激活YAP進而上調(diào)下游靶基因表達水平，而又因亞砷酸鈉對細胞的毒性損傷作用，使YAP應(yīng)激性地清除受損細胞導(dǎo)致細胞的增殖能力下降，但具體機制還有待進一步深入探討。