賈 媛 高 蘭 公 雯

南京市江寧中醫(yī)院藥學部，江蘇南京 211100

頸椎病是臨床常見的退行性疾病，主要由頸椎間盤變性等引起。臨床主要表現(xiàn)為頸肩部出現(xiàn)陣發(fā)性痙攣或麻木，嚴重者可致四肢癱瘓[1]。隨著人口老齡化加劇，工作、生活習慣的改變，其發(fā)病率逐年升高，且年輕化趨勢顯著。

項痹暈寧湯作為南京市江寧中醫(yī)院經(jīng)典驗方，臨床上已使用多年。組方為葛根、天麻、當歸、炒白芍、玄胡、柴胡、川芎、姜半夏八味，諸藥合用，對于頸椎病臨床療效顯著。但因組方復雜，其作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡藥理學通過藥理學、生物信息學等多學科的融合，能夠初步揭示中藥-成分-疾病的作用機制[2]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學初步探究項痹暈寧湯治療頸椎病的機制，為后續(xù)新藥開發(fā)和臨床應用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及靶點預測

選擇TCMSP、BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫，以組方中八味中藥為關鍵詞檢索化學成分，未被收錄的中藥通過文獻檢索。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為限制條件篩選活性成分。再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對活性成分進行靶點預測，并用UniProt數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范。

1.2 構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡

將獲得的潛在靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡，用“節(jié)點”表示活性成分或潛在靶點，用“邊”表示兩者潛在關系；再通過Network Analyze工具分析計算，以推測活性成分和靶點之間的內(nèi)在聯(lián)系[3]。

1.3 篩選頸椎病相關靶點

以“Cervical spondylosis”“Neck pain”作為關鍵詞，檢索GeneCards、Drugbank等疾病數(shù)據(jù)庫，整合與頸椎病相關的靶基因，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范。

1.4 構建蛋白相作網(wǎng)絡（PPI）及篩選核心靶點

分別將成分潛在靶點及疾病靶點導入Cytoscape軟件，生成PPI網(wǎng)絡后，合并提取交集網(wǎng)絡。再利用CytoNCA分析各個節(jié)點的屬性值，并計算交集PPI網(wǎng)絡拓撲學特征屬性值，并對其進行策略篩選，最終得到關鍵核心靶點。

1.5 通路富集分析

將上述核心靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫，對其進行GO及KEGG富集分析，并將結果進行可視化。

2 結果

2.1 活性成分及靶點獲取

項痹暈寧湯中滿足條件的活性成分有葛根4種、天麻4種、當歸2種、炒白芍8種、玄胡49種、柴胡13種、川芎6種、姜半夏12種，結果見表1。經(jīng)靶點預測共獲得244個藥物靶點。

2.2 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建及分析

將項痹暈寧湯成分與靶點關系網(wǎng)絡通過Cytoscape軟件繪制與分析，獲得336個節(jié)點（其中84個活性成分和244個潛在藥物靶點）與1998條關系，結果見圖1。根據(jù)表1、圖1可知，與潛在靶點連線較為緊密的成分有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等，推測這些化合物可能為項痹暈寧湯主要活性成分。

表1 項痹暈寧湯活性成分

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 頸椎病相關靶點檢索

檢索GeneCards、Drugbank數(shù)據(jù)庫，匯總整理，累計獲得1032個疾病靶點。其與藥物靶點交集有105個。

2.4 項痹暈寧湯-頸椎病的PPI網(wǎng)絡分析

運用Cytoscape軟件構建交集PPI網(wǎng)絡。結果顯示，與藥物相關靶點5527個，相互關系136 070種；與頸椎病相關靶點有11 207個，相互關系226 832種，再取交集PPI網(wǎng)絡。依據(jù)交集PPI的網(wǎng)絡拓撲學特征屬性值，篩選獲得關鍵核心靶點204個，見圖2。計算Degree值，其中排名靠前的神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體 1（NTRK1）、腫瘤蛋白 P53（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、淀粉樣前體蛋白（APP）等可能是項痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點。

圖2 核心靶點PPI網(wǎng)絡

2.5 項痹暈寧湯治療頸椎病通路富集分析

將關鍵核心靶點導入Metascape，分別對GO及KEGG進行富集分析，選取Log10（P）值排名前20的結果繪制氣泡圖，氣泡面積即基因計數(shù)，橫坐標為通路基因占全部基因的比率，具體見圖3～6。通過P值篩選，結合文獻，其關鍵的信號通路可能包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。

圖3 GO BP分析

3 討論

頸椎病是因勞損或風寒濕邪入體，痹阻手太陽經(jīng)脈，不通則痛；臨床也認為該病是機體氣血不足，筋脈失養(yǎng)后，氣血虛和太陽經(jīng)脈瘀滯所致[4]。項痹暈寧湯是在中醫(yī)理論基礎上，結合臨床用藥經(jīng)驗組方而成，主要用于治療頸椎病所致的頭頸痛、頭暈目眩等臨床癥狀。

圖4 GO CC分析

圖5 GO MF分析

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

本研究共篩選出84種活性成分，244個藥物靶點。項痹暈寧湯治療頸椎病的主要成分可能為槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等。槲皮素通過上調神經(jīng)元的內(nèi)在生長能力和延緩遠端萎縮，增強軸突再生和運動神經(jīng)傳導；此外還增加了環(huán)磷酸腺苷的表達和下游通路的激活，促進小鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后的行為恢復[5-6]。豆甾醇能夠通過對抗IL-1β誘導的細胞凋亡NF-κB通路，減少骨關節(jié)炎引起的軟骨退化[7]；也可抑制基質金屬蛋白酶的表達，減少軟骨的降解[8]。β-谷甾醇通過減少合成NO，減少炎性因子的分泌[9]。山柰酚能抑制血小板活化，預防和治療血栓性疾病[10]?？ňS丁可能通過受體阻斷或刺激疼痛神經(jīng)末梢釋放來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[11]。

PPI網(wǎng)絡結果顯示項痹暈寧湯靶點與頸椎病靶點間存在諸多交互關系，篩選后共得出204個核心靶點。根據(jù)Degree值排名，NTRK1、YP53、EGFR、APP等可能是項痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點。GO分析發(fā)現(xiàn)，項痹暈寧湯主要涉及DNA修復、細胞應激反應調節(jié)、對生長因子反應等生物學過程；涉及蛋白質域特異性結合、轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合等細胞組分。KEGG生物途徑中看出，PI3K/Akt信號通路激活可抑制頸肌細胞凋亡，修復勞損頸肌，恢復頸椎的靜力平衡[12]。TNF信號通路中TNF-α是引起退變椎間盤炎癥反應的始動因子，可引起IKK活化，加重炎癥損傷。此外miR-146受到TNF-α等刺激時負反饋調節(jié)炎癥性細胞因子的產(chǎn)生[13-14]。MAPK可能通過炎癥引起的神經(jīng)病理性疼痛潛在的藥物干預靶點參與細胞增殖分化[15]。