王丹 林志強 阮永春 周宜慶 李明暉

(浙江大學紹興醫(yī)院 紹興市人民醫(yī)院，紹興 312000)

腸球菌是一類廣泛存在于土壤、植物以及人類和動物胃腸道中的革蘭陽性球菌，它是人類及動物腸道微生物組的核心成員，維持著機體微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。從醫(yī)院獲得性感染患者中分離到的常見微生物中，腸球菌排名基本在第2～3位[1]。隨著抗生素的廣泛應用，由于腸球菌對抗生素的敏感性下降，導致了耐藥菌的大量出現(xiàn)，其引起疾病挑戰(zhàn)日益加劇。耐萬古霉素腸球菌(vancomycin resistantEnterococcus,VRE)自20世紀80年代中期被發(fā)現(xiàn)后，隨即在全球蔓延，甚至在一些醫(yī)院發(fā)現(xiàn)多達80%的屎腸球菌分離株對萬古霉素耐藥[2]。耐藥腸球菌的產生不僅加大了臨床抗感染工作的難度，而且導致大量社會醫(yī)療資源被占用、耗損，促使其成為了一個需迫切解決的重要公共衛(wèi)生問題。

為了解本院腸球菌的耐藥現(xiàn)狀以及近年來細菌耐藥性的動態(tài)變化，本研究收集2015年1月—2020年12月本院住院患者臨床分離的腸球菌實驗室資料及相關的臨床信息，進行回顧性分析，通過對本院腸球菌的感染情況、耐藥菌的臨床分布特點及耐藥趨勢變遷分析，為臨床合理使用抗感染藥物提供有力依據，有效減少耐藥菌的產生。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2015年1月—2020年12月我院各類臨床標本中檢出的所有腸球菌屬菌株，標本均由我院臨檢中心微生物室參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會推薦的藥敏試驗要求檢出并審核，且所有的標本采集符合我院臨床檢驗標本采集規(guī)范，同一患者同一部位檢出的重復株以第1次計算。

1.2 儀器

藥敏紙片由Oxoid公司提供；E試驗條由Bio-Merieux公司提供；BioMerieux全自動微生物鑒定儀Vitek 2 Compact。

1.3 實驗方法

運用法國Bio- Merieux全自動微生物鑒定儀進行菌株鑒定以及最低抑菌濃度檢測，采用紙片法或自動化儀器法進行抗菌藥物耐藥性檢測，質控菌株：糞腸球菌ATCC29212。藥敏試驗參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會推薦的藥敏試驗方法進行并判讀結果，其中替加環(huán)素的判斷標準按美國食品藥品監(jiān)督管理局文件標準。用MH培養(yǎng)基進行藥敏試驗，涂布完成后將接種好的平板在15 min內放置35℃孵育18～24 h。四環(huán)素、替考拉寧、氨芐西林、高濃度慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素和萬古霉素常規(guī)采用K-B法藥敏試驗。對萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧的紙片或自動化檢測為不敏感菌株時，則采用萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧E試驗條測試MIC值確認。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 21軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸球菌屬菌種分布

2015年1月—2020年12月我院共檢出腸球菌2396株，包括糞腸球菌(E.faecalis)11204株，屎腸球菌874株(E.faccium)，鶉雞腸球菌(E.gallinarum)123株，鳥腸球菌(E.avium)70株，鉛黃腸球菌(E.casselifavus)76株，海氏腸球菌(E.hirae)17株；棉子糖腸球菌(E.raffinosus)16株；耐久腸球菌(E.durans)15株；哥倫比亞腸球菌(E.columbae)1株；分布以糞腸球菌和屎腸球菌為主，糞腸球菌占50.25%，屎腸球菌占36.48%，鶉雞腸球菌占5.13%，而海氏腸球菌、棉子糖腸球菌、耐久腸球菌 以及哥倫比亞腸球菌占比均不足1%，見表1。

表1 2015—2020年分離腸球菌屬菌種基本情況Tab.1 Basic information of Enterococcus strains isolated from 2015 to 2020

2.2 腸球菌屬臨床標本分布情況

2396株腸球菌臨床分離標本中尿液共1070 株(占44.65%)，膽汁747株(占31.17%)，引流液263株(占10.97%)，血液97株(占4.05%)，分泌物67株(占2.79%)，膿液54株(占2.25%)，腹水27株(占1.13%)；而導管、痰液、胸水、腦脊液、前列腺液、關節(jié)液等檢出菌株少，占比不足0.5%。尿液標本所占比例逐年下降，膿液、膽汁、引流液標本所占比例上升。分離腸球菌屬臨床科室以外科為主，共1662株(占69.36%)，內科462株(占19.28%)，ICU、急診183株(占7.64%)，兒科及婦科占比不足5%，見表2。

表2 2015—2020年腸球菌屬臨床標本及科室分布Tab.2 Clinical specimens and department distribution of Enterococcus from 2015 to 2020

2.3 腸球菌對不同抗生素的藥敏情況

2015年1月—2020年12月屎腸球菌對左氧氟沙星耐藥率高于75%，對氨芐西林、紅霉素的耐藥率高于80%，對利奈唑胺、喹努普汀/達福普汀耐藥率低于10%，對替加環(huán)素、替考拉寧、萬古霉素耐藥率低于5%。6年來屎腸球菌中共檢出VRE 9株，利奈唑胺耐藥株35株，替加環(huán)素耐藥株6株，替考拉寧耐藥株16株，高濃度鏈霉素耐藥率由59.2%下降至28.7%，呈現(xiàn)逐年下降趨勢(P＜0.001)，高濃度慶大霉素耐藥率從61.2%下降至28.8%(P＜0.001)，但呋喃妥因耐藥率由46.6%上升至61.5%(P＜0.05)，見表3。

2015—2020年糞腸球菌對喹努普汀/達福普汀耐藥率均高于70%，對四環(huán)素耐藥率高于48%，對高濃度慶大霉素耐藥率高于20%，而環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氨芐西林和青霉素G耐藥率則低于25%，呋喃妥因、替加環(huán)素和萬古霉素耐藥率均低于4%。所有糞腸球菌中共檢出耐萬古霉素菌株5株，替加環(huán)素耐藥株4株，見表3。縱觀6年整體耐藥率顯示屎腸球菌對高濃度鏈霉素、喹諾酮類、氨芐西林、青霉素G、呋喃妥因、紅霉素耐藥率明顯高于糞腸球菌(P＜0.001)，而糞腸球菌對四環(huán)素、喹努普汀/達福普汀的6年整體耐藥率高于屎腸球菌(P＜0.001)。

表3 屎腸球菌和糞腸球菌對抗菌藥物的耐藥率Tab.3 Drug resistance rate of E.faecium and E.faecalis to antibiotics

2015—2020年鉛黃腸球菌對萬古霉素耐藥率達98%以上，紅霉素耐藥率高于90%，而對四環(huán)素、利奈唑胺耐藥率均低于15%，環(huán)丙沙星、莫西沙星、氨芐西林、呋喃妥因耐藥率均低于5%，所有菌株中未檢出替加環(huán)素以及高濃度慶大霉素耐藥株；鶉雞腸球菌對紅霉素、萬古霉素耐藥率高于80%，對喹努普汀/達福普汀耐藥率高于50%，而對高濃度慶大霉素、莫西沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、高濃度鏈霉素、呋喃妥因耐藥率均低于30%，對利奈唑胺耐藥率則低于10%，菌株中亦未檢出替加環(huán)素耐藥株；鳥腸球菌對四環(huán)素、氨芐西林耐藥率高于50%，對利奈唑胺、莫西沙星、環(huán)丙沙星、替加環(huán)素和萬古霉素耐藥率低于10%，所有檢出鳥腸球菌菌株中發(fā)現(xiàn)耐替加環(huán)素菌株1株，見圖1。其他腸球菌屬分離出菌株數(shù)少，6年來不足20株，無明顯代表意義，故對其藥敏試驗數(shù)據不作統(tǒng)計和分析。

圖1 2015-2020年其他腸球菌屬對不同抗菌藥物的耐藥率Fig.1 Different antibiotic resistance rates of other Enterococcus genera

3 討論

腸球菌是革蘭陽性、兼性厭氧球菌，可在10℃～45℃環(huán)境生長，亦能在pH4.4～9.6范圍內生長，在6.5% NaCl的高鹽介質中也能生長[3]。腸球菌是人類和動物的共生菌群，以前被認為是臨床影響最小的微生物，現(xiàn)在已成為人類常見的機會致病菌[1]。作為最常見的院內病原體之一，腸球菌可引起嚴重的感染和疾病，如心內膜炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)、腹腔和盆腔感染、中樞神經系統(tǒng)感染等。縱觀中國細菌耐藥性監(jiān)測網腸球菌檢出率呈逐年增加趨勢，從2015年檢出腸球菌共7876株，2016年檢出12759株腸球菌，2017年檢出16043株，到2018年檢出腸球菌株數(shù)高達18717株[4-7]。另一項研究關于2014—2018年加拿大70所醫(yī)院100萬住院治療的患者回顧性分析結果表明，腸球菌檢出率顯著增加，其中VRE感染增加了148%[8]。這些結果的出現(xiàn)與近年抗菌藥物的不合理應用、侵入性操作的大量開展以及免疫抑制人群增多等諸多因素息息相關。中國細菌耐藥監(jiān)測網顯示逐年增多的腸球菌屬檢出均以屎腸球菌為主[4-7]，2015年檢出腸球菌菌株中糞腸球菌、屎腸球菌分別占42.7%和50.1%，兩者比例相當，2018年檢出糞腸球菌、屎腸球菌分別占腸球菌株39.5%和52.8%，屎腸球菌檢出比例顯著上升。然而在我院連續(xù)6年檢出的2396株腸球菌中糞腸球菌占50.25%，屎腸球菌占36.48%，構成比雖與全國細菌耐藥監(jiān)測網數(shù)據相近，但結果仍以糞腸球菌為主，考慮可能與我院腸球菌屬檢出標本大部分來源于外科(占69.36%)，患者診治的疾病迥異以及對抗生素需求不同等因素有關。隨著導管、支架等侵入性治療在臨床被越來越多的應用，腸球菌屬仍是引起尿路感染的第2大病原菌[3]。在本研究中，2396株腸球菌有1070株分離自臨床尿液標本，占比44.65%，分析原因首先考慮腸球菌是泌尿道的定植菌，其次尿路感染的診斷絕大部分來自于中段尿培養(yǎng)提供的微生物證據，因此在尿路感染中腸球菌屬仍是重要的病原菌。但針對尿路感染患者的經驗性抗生素治療時，仍應綜合評估患者情況決定是否覆蓋腸球菌。臨床上呼吸系統(tǒng)、腦脊液、前列腺和骨關節(jié)等不是腸球菌的常見定植部位，故上述部位檢出腸球菌菌株少，本研究檢出菌株分布結果也與之相符。

我院臨床分離的腸球菌對替加環(huán)素、替考拉寧、利奈唑胺和萬古霉素普遍敏感，但鉛黃腸球菌對萬古霉素耐藥率達98%，鶉雞腸球菌耐藥率高達85%，分析與這兩種菌屬都攜帶相同染色體基因簇，參與了vanC和vanT基因編碼合成的肽聚糖前體有關[9]，因此在治療這兩種細菌引起的疾病時應避免使用萬古霉素，通過合理選擇抗生素以積極遏制耐藥菌播散。另鉛黃腸球菌對呋喃妥因耐藥率低于5%，這與張娜等[10]的研究結果一致，呋喃妥因在尿液中藥物濃度較高，細菌耐藥率低，故可作為上述細菌引起尿路感染的經驗治療。鳥腸球菌對莫西沙星、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、替加環(huán)素和萬古霉素耐藥率低，但也已檢出替加環(huán)素、萬古霉素耐藥株，臨床應引起高度重視。耐萬古霉素屎腸球菌、糞腸球菌株經耐藥表型檢測或PCR檢測出常見的耐藥基因為vanA、vanB、vanM型，而其中vanA介導的耐藥性通常高于其他類型，并可引起細菌對替考拉寧的交叉耐藥。目前研究者已發(fā)現(xiàn)vanA基因簇可跨越種屬轉移的質粒和轉座子播散至其他菌種，包括耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)的臨床分離株等，這些發(fā)現(xiàn)都強烈顯示耐萬古霉素的基因簇可以跨越菌種屏障傳播，更深刻地提醒我們需積極阻止抗菌藥物的濫用，限制抗生素的選擇[11-12]。屎腸球菌被發(fā)現(xiàn)對多種抗生素有耐藥性，這一特點使其能在敏感微生物被抗生素清除時仍繼續(xù)存活并增殖，同時也是屎腸球菌能在院內感染中獲得一席之地的重要原因。在本研究中，我院檢出的屎腸球菌對喹諾酮類、氨芐西林、紅霉素、呋喃妥因、高濃度鏈霉素和高濃度慶大霉素的耐藥率6年來持續(xù)處于高水平，但有逐年下降趨勢，提示近年臨床抗菌藥物使用合理，但基于總體的高水平耐藥率以及對多種抗生素耐藥的特點仍建議抗感染治療屎腸球菌時避免使用上述藥物。新型鏈陽菌素喹努普汀/達福普汀對其耐藥率6年來均低于10%，提示臨床該藥可用于治療屎腸球菌引起的感染性疾病，但仍需注意藥物不良反應。我院檢測出的糞腸球菌對喹諾酮類、青霉素G、氨芐西林和呋喃妥因總體耐藥率低，仍可作為治療糞腸球菌感染的首選藥物。雖然對高濃度鏈霉素、高濃度慶大霉素耐藥率高于20%，但值得慶幸的是，糞腸球菌對兩者的耐藥率呈逐年下降的變化，如臨床需要，亦可考慮氨芐西林聯(lián)合慶大霉素治療該菌，但方案應結合感染部位進行綜合選擇。越來越多研究發(fā)現(xiàn)腸球菌可通過接合的方式，從質粒、轉座子、大片斷的染色體DNA等途徑獲取新的耐藥基因[13]，使定植菌群獲得更強的耐藥性，基于此希望在工作中盡可能根據藥敏情況合理選擇抗生素，避免細菌耐藥性的出現(xiàn)。從我院連續(xù)6年的耐藥率分析，除四環(huán)素、喹努普汀/達福普汀外，糞腸球菌整體耐藥率低于屎腸球菌，而對于利奈唑胺、替加環(huán)素及萬古霉素兩者整體耐藥率無明顯變化。不同腸球菌屬細菌對不同抗生素耐藥率不同，即便同一種抗生素對不同的腸球菌屬細菌耐藥率也存在明顯差異，在臨床治療過程中，應根據細菌臨床分布特點以及本院的耐藥性變遷合理選擇抗生素，防止耐藥菌的進一步增長。