杭修兵 肖曉 儲(chǔ)雯雯 葉乃芳 劉周

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230601)

血流感染是指由細(xì)菌、真菌等病原體入侵血流所致的全身性感染，屬于臨床重癥感染性疾病[1]。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)屬于腸桿菌目克雷伯菌屬，是導(dǎo)致醫(yī)院和社區(qū)感染的主要病原菌之一[2-3]。隨著廣譜抗菌藥物的濫用，碳青霉烯耐藥KPN(carbapenem-resistance KPN,CRKP)檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，使得血流感染治療難度增加[4]。近年來(lái)CRKP不僅表現(xiàn)為多重耐藥，而且通過(guò)獲得毒力質(zhì)粒進(jìn)化為高毒力、高耐藥性菌株，使得臨床感染蔓延趨勢(shì)更為嚴(yán)重[5-6]。研究表明，社區(qū)與院內(nèi)血流感染KPN在臨床特征、毒力因子以及分子生物學(xué)特征上存在一定差異，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)監(jiān)測(cè)具有重要臨床意義[7]。本研究回顧性分析安徽地區(qū)某省級(jí)綜合性三級(jí)甲等醫(yī)院2019年1月至2020年12月住院患者送檢血液標(biāo)本中KPN的臨床特征和耐藥情況，并對(duì)其毒力基因和相關(guān)分子生物學(xué)特征進(jìn)行研究分析，以期為血流感染KPN的臨床診治和耐藥防控提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2019年1月至2020年12月安徽地區(qū)某省級(jí)綜合性三級(jí)甲等醫(yī)院的臨床血流感染患者血培養(yǎng)分離的91株KPN(剔除重復(fù)菌株)。本研究納入標(biāo)準(zhǔn)為住院血流感染患者中至少一次血培養(yǎng)分離出KPN，并達(dá)到血流感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；同時(shí)排除標(biāo)準(zhǔn)為：① 病史資料不全，② 患者年齡＜14歲，③ 兩種及以上細(xì)菌混合感染。最終共計(jì)72株KPN納入本研究，同時(shí)收集對(duì)應(yīng)住院患者主要臨床資料，包括年齡、性別、入住ICU天數(shù)、基礎(chǔ)疾病、接受侵襲性診療操作與發(fā)生KPN血流感染前使用碳青霉烯類藥物情況、患者臨床轉(zhuǎn)歸。根據(jù)臨床感染類型分組，其中感染發(fā)生入院48 h后為醫(yī)院血流感染(hospital-acquired bloodstream infection,HABSI)組，感染發(fā)生于入院4 8 h以內(nèi)為社區(qū)血流感染(community-onset bloodstream infection,COBSI)組[9]。研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審查同意(批準(zhǔn)號(hào)：PJ-YX2018-001)。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)

常規(guī)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)純化細(xì)菌，應(yīng)用德國(guó)Bruker-Microflex LT型質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定，應(yīng)用法國(guó)BioMérieux Vitek-2型全自動(dòng)分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判定參照CLSI 2019版標(biāo)準(zhǔn)[10]。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定多黏菌素B的(minimum inhibitory concentration,MIC)MIC值，結(jié)果按EUCAST標(biāo)準(zhǔn)判定(http://www.eucast.org)。CRKP的判定標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)亞胺培南、美羅培南及厄他培南3者任意一種耐藥的KPN。應(yīng)用改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)及EDTA改良滅活試驗(yàn)(eCIM)檢測(cè)CRKP菌株的碳青霉烯酶表型[10]。

1.3 多位序列分型、莢膜血清型及毒力基因檢測(cè)

應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)進(jìn)行KPN的序列分型檢測(cè)，擴(kuò)增包括gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB在內(nèi)的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的管家基因，擴(kuò)增條件及方法參見文獻(xiàn)[11]，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后確定等位基因，應(yīng)用MLST網(wǎng)站進(jìn)行序列類型(sequence type，ST)鑒定。將等位基因gapA-infBmdh-pgi-phoE-rpoB-tonB按順序整理，并根據(jù)其差異將ST型分為單個(gè)位點(diǎn)變異型(single-locus variants,SLVs)、雙位點(diǎn)變異型(double-locus variants,DLVs)及三位點(diǎn)變異型(triple-locus variants,TLVs)。應(yīng)用goeBurst軟件建立最小生成樹，確定ST型中的克隆群主型(group founder,GF)及亞克隆群主型(sub-group founder,sub-GF)[12]。

應(yīng)用PCR方法檢測(cè)了10種毒力相關(guān)基因，包括iucA、allS、iroB、kfu、mrkD、rmpA、rmpA2、ureA、wabG和ybtS，PCR引物及擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn)[13]。應(yīng)用PCR聯(lián)合測(cè)序技術(shù)檢測(cè)KPN菌株莢膜wzi分型，PCR引物及擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn)[14]。

1.4 全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Illumina NovaSeq測(cè)序儀對(duì)CRKP菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi)分析毒力基因；應(yīng)用Resfinder和PlasmidFinder分析耐藥基因及質(zhì)粒特征。應(yīng)用在線服務(wù)器(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny/)分析單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)，然后將結(jié)果導(dǎo)入軟件FigTree 1.4.3，生成最大似然樹。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用WHONET5.6軟件對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，其他統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 21.0軟件。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間率的比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床感染特征分析

72例KPN血流感染患者中，54.2%為HABSI組(39例)，45.8%為COBSI組(33例)。兩組患者在年齡、性別及基礎(chǔ)疾病方面均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。HABSI組患者入住ICU天數(shù)＞10d比例高于COBSI組(P＜0.05)。在發(fā)生血流感染前，HABSI組患者接受侵入性操作及使用碳青霉烯類藥物的比例也顯著高于COBSI組(P＜0.05)。比較臨床預(yù)后可見，HABSI組患者治愈或好轉(zhuǎn)的比例顯著低于COBSI組(P＜0.05)。具體臨床特性見表1。

表1 HABSI組和COBSI組患者的臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between HABSI group and COBSI group

2.2 抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，72株KPN對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均在34.7%～48.6%，亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率均為26.4%，替加環(huán)素耐藥率為1.4%，未檢出多黏菌素B的耐藥株。HABSI組KPN對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南的耐藥率均為48.7%，而COBSI組未檢出碳青霉烯耐藥菌株。除多黏菌素B和替加環(huán)素外，HABSI組KPN對(duì)抗菌藥物耐藥率均顯著高于COBSI組(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2 HABSI和COBSI組的KPN對(duì)抗菌藥物耐藥率Tab.2 The resistance rates of KPN with HABSI group and COBSI group

2.3 分子分型及毒力基因檢測(cè)

MLST結(jié)果顯示，HABSI組包含23種ST型，其中ST11型16株(41.0%)、ST15型2株(5.1%)，其余ST1、ST14、ST17、ST39、ST65、ST101、ST107、ST218、ST220、ST234、ST307、ST334、ST592、ST906、ST1386、ST1496、ST1630、ST1699、ST1803、ST1899及ST2494各1株(各占2.56%)。COBSI組中包含24種ST型，其中ST23型4株(12.1%)，ST86型3株(9.1%)，ST25、ST65、ST231及ST412各2株(6.1%)，ST14、ST17、ST20、ST37、ST163、ST200、ST276、ST307、ST380、ST511、ST586、ST595、ST611、ST661、ST685、ST1627、ST1786及ST1798各1株(各占3.03%)。

GoeBURST分析顯示，HABSI組中ST220為GF，ST11、ST65和ST39等為sub-GF，ST15和ST1630為ST11的TLVs；COBSI組中ST23為GF，ST511、ST65和ST412為sub-GF，ST163為ST23的SLV，ST17、ST25和ST276均為ST23的DLVs，見圖1。

圖1 HABSI組菌株(A)與COBSI組菌株(B)ST型的goeBURST分析圖Fig.1 GoeBURST analysis of HABSI group and COBSI group isolates’ sequence type

莢膜分型顯示，HABSI組菌株中38.5%為K64型，K125、K19和K57型分別占10.3%、5.1%和5.1%，COBSI組菌株莢膜型中K2、K1和K57分別占21.2%、12.1%和6.1%，見表3。

表3 HABSI組和COBSI組莢膜分型及毒力因子分析Tab.3 Capsular serotype and virulence factor analysis of HABSI group and COBSI group

毒力基因分析顯示，pLVPK-like毒力質(zhì)粒相關(guān)的毒力因子rmpA、rmpA2以及iucA在HABSI組和COBSI組攜帶率分別為56.4%、61.6%、46.2%與30.3%、48.5%和33.3%。

2.4 CRKP全基因組測(cè)序分析

共檢出19株CRKP，根據(jù)其分離的先后順序，將19株CRKP依次命名為CRKP 01～19。mCIM及eCIM試驗(yàn)顯示，所有CRKP菌株mCIM試驗(yàn)均為陽(yáng)性，5.3%(1/19)菌株eCIM試驗(yàn)陽(yáng)性。Resfinder分析顯示，上述eCIM試驗(yàn)陽(yáng)性菌株(1株，5.3%)攜帶blaNDM-1，其余mCIM陽(yáng)性CRKP(18株，94.7%)攜帶blaKPC-2。所有CRKP均攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)基因，包括blaCTX-M-65(73.7%)、blaSHV-12(84.2%)和blaTEM-1(78.9%)等。耐藥基因tet(A)和fosA攜帶率為84.2%和68.4%。

分子分型結(jié)果顯示，84.2%(16/19)的CRKP屬于ST11型，且K64為ST11-CRKP主要莢膜型(15株，93.8%)，SNP分析顯示所有ST11-CRKP具有高度親緣關(guān)系。PlasmidFinder分析顯示，CRKP攜帶IncF11、IncR及IncHI1B型質(zhì)粒的比例分別為94.7%(18/19)、78.9%(15/19)及63.2%(12/19)。其中攜帶IncHI1B型質(zhì)粒的CRKP均屬于K64-ST11型，其rmpA、iucA和rmpA2基因攜帶率分別為100%(12/12)、91.7%(11/12)和91.7%(11/12)。見圖2。

圖2 CRKP相關(guān)耐藥基因、毒力基因及質(zhì)粒分布情況Fig.2 Distribution of resistance genes,virulence genes and plasmids in 19 CRKP isolates

3 討論

KPN是臨床血流感染的常見病原體，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床廣泛使用，KPN的耐藥趨勢(shì)不斷上升。研究表明，醫(yī)院感染與社區(qū)感染KPN對(duì)抗菌藥物的耐藥性有一定的差異，醫(yī)院獲得性血流感染KPN菌株常常攜帶多種耐藥基因，呈現(xiàn)多重耐藥表型，導(dǎo)致患者住院時(shí)間增加、病死率升高，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[15-16]。本研究72例患者中醫(yī)院獲得性占54.2%(39例)，且臨床預(yù)后醫(yī)院組比社區(qū)組患者差，與上述報(bào)道基本一致。

ICU是易發(fā)生血流感染的主要科室之一，這與ICU患者住院周期長(zhǎng)、病情危重以及長(zhǎng)時(shí)間或大劑量使用抗生素等特點(diǎn)有關(guān)[17]。本研究數(shù)據(jù)顯示，HABSI組患者入住ICU天數(shù)＞10d比例高于COBSI組，入住ICU天數(shù)的延長(zhǎng)可能會(huì)增加HABSI的感染風(fēng)險(xiǎn)。在侵入性治療方面，發(fā)生KPN血流感染前進(jìn)行侵襲性診療操作患者的比例HABSI組顯著高于COBSI組。研究表明，對(duì)于侵襲性診療操作，如置管、穿刺、氣管插管等有創(chuàng)操作更容易引起HABSI[18]。因此，在進(jìn)行院感防控時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注ICU病區(qū)，增強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員的無(wú)菌操作觀念，以防多重耐藥菌通過(guò)手部污染物體表面。同時(shí)臨床和院感部門應(yīng)盡量加強(qiáng)侵入性操作的評(píng)估，掌握合理的拔管指征。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，除多黏菌素B和替加環(huán)素外，HABSI組KPN對(duì)抗菌藥物耐藥率均顯著高于COBSI組，其中HABSI組菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率高達(dá)48.7%，值得臨床高度關(guān)注。進(jìn)一步對(duì)HABSI組的CRKP菌株進(jìn)行耐藥基因分析可見，所有CRKP均攜帶包括碳青霉烯耐藥基因在內(nèi)的多個(gè)耐藥基因。質(zhì)粒分析提示CRKP都攜帶了一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒復(fù)制子，其中以IncFII和IncR為主。研究表明，IncFII和IncR質(zhì)粒通常攜帶不同的耐藥基因，并且可以在醫(yī)院環(huán)境中傳播，從而造成多重耐藥菌株的播散[19]。HABSI組在發(fā)生KPN血流感染前使用過(guò)碳青霉烯類藥物的比例明顯高于COBSI組，提示碳青霉烯類藥物的過(guò)度使用可能會(huì)增加CRKP菌株產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床科室、藥學(xué)部門及醫(yī)院感染管理部門應(yīng)高度重視，規(guī)范使用抗菌藥物，采取嚴(yán)格的消毒隔離措施，避免KPN多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播。

本研究中84.2%的CRKP為ST11型，該類型是中國(guó)地區(qū)CRKP的主要流行克隆群[16]。通過(guò)莢膜分型，ST11型可分為K47-ST11及K64-ST11兩個(gè)亞克隆型，而近年來(lái)K64-ST11型CRKP逐漸取代了K47-ST11型，成為臨床主要流行的亞克隆[20]。本文中，K64-ST11亞克隆型檢出比例高達(dá)93.8%，同時(shí)SNP分析顯示其具有高度的親緣關(guān)系，提示該亞克隆型可能存在醫(yī)院內(nèi)感染播散；且HABSI組菌株多種質(zhì)粒介導(dǎo)的毒力因子(如rmpA、rmpA2和iucA等)陽(yáng)性率較高，同時(shí)HABSI組中CRKP菌株攜帶IncHI1B型質(zhì)粒的比例高達(dá)63.2%。IncHI1B型質(zhì)粒是KPN菌株中pLVPK-like毒力質(zhì)粒的主要分子型別，該型質(zhì)粒中常攜帶了包括rmpA、rmpA2、iucA及ybtS等在內(nèi)的多種毒力質(zhì)粒。毒力質(zhì)粒pLVPK-like被認(rèn)為是高毒力KPN(hypervirulent KPN，hvKP)的關(guān)鍵分子標(biāo)志，一般情況下由K1-ST23型及K2-ST86型hvKP天然攜帶[21]，這也提示本地區(qū)已經(jīng)存在攜帶IncHI1B型pLVPK-like毒力質(zhì)粒CRKP菌的醫(yī)院感染流行趨勢(shì)，應(yīng)加強(qiáng)防控。

由于納入研究的菌株及病例數(shù)量較少，使得本研究存在一定的局限性，需進(jìn)一步對(duì)KPN進(jìn)行廣度和深度及多部門的協(xié)作研究，后續(xù)將繼續(xù)收集臨床分離菌株，密切監(jiān)控血流感染中K64-ST11型CRKP菌株的流行趨勢(shì)，為制定相應(yīng)的感染控制措施，防控多重耐藥菌的院內(nèi)傳播流行提供參考數(shù)據(jù)。