吳光旭 吳紅林 李吉順 李天磊2, 吳松,* 潘衛(wèi)東

(1 貴州醫(yī)科大學，藥學院/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550025；2 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 550014；3 中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 天然產物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

黃酮類天然產物廣泛分布于植物界中，該類天然產物具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等，不同類型的黃酮類化合物被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等領域。近年來，黃酮類化合物的抗菌活性日益受到重視[1]，黃酮類化合物主要通過抑制細菌DNA合成[2]、改變膜電位和細胞膜功能[3]及抑制細菌能量代謝[4-5]等多種作用機制發(fā)揮抗菌作用。前期研究顯示不同植物來源的黃酮提取物具有較為廣泛的抗菌活性[6]，尤其是3-羥基黃酮類天然產物活性較為突出，其主要的抗菌活性-構效關系總結如圖1。目前，針對槲皮素(quercetin)、高良姜素(galangin)、蘆丁(rutin)、山柰酚(kaemperol)及其結構修飾產物等的抗菌活性研究較多(圖1)[7-10]，但是對楊梅素(myricetin)及其糖苷衍生物抗菌活性研究較少。

圖1 具有抗菌活性的代表黃酮苷類衍生物及其構效關系總結[7-10]Fig.1 Summary of representative flavonoid glycoside derivatives and structure-activity relationship[7-10]

當前，細菌對抗菌藥物的耐藥性日益增強，正成為對公共健康的嚴重威脅。在臨床細菌感染疾病中，幾乎70%的病原菌表現出對一種或多種抗菌藥不同程度的耐受[11-12]。在當前細菌對臨床藥物耐受全面加劇和新型抗生素研發(fā)進展緩慢的雙重夾擊下，從天然產物中尋找和發(fā)現抗菌先導化合物是當下發(fā)現新型抗菌藥物最具前景的途徑之一[13-15]。為了發(fā)現具有抗菌活性的黃酮醇類化合物，本研究以天然產物楊梅苷作為原料，通過不同的保護策略、烷基化、酯化反應和糖苷化反應制備合成了14個楊梅素衍生物，對目標化合物進行了金黃色葡萄球菌、腸球菌和表皮葡萄球菌抑菌活性測試，并對其抗菌活性構效關系進行了初步探索。

1 材料

1.1 主要儀器

磁力攪拌器 (IKA RCT Basic)，旋轉蒸發(fā)儀(EYELA SB-1300)，超導核磁共振波譜儀(Bruker AV-500)，高效液相-單級桿質譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITY QDa)，高效液相色譜儀(Shimadzu LC-6AD)，低溫反應儀器(EYELA PSL-1810)，酶標儀(Multiskan FC) 。

1.2 主要試劑

N,N-二甲基甲酰胺，甲醇，四氫呋喃，異丙醇，鹽酸-二氧六環(huán)溶液，碳酸銫，4-二甲氨基吡啶，二環(huán)己基碳二亞胺，鈀碳，溴芐，對甲苯磺酸-一水合物，全乙?；肴樘?，楊梅苷。

2 實驗方法

2.1 楊梅素類衍生物合成

前期文獻報道，3-羥基黃酮醇類半乳糖苷類衍生物顯示較好的抗菌活性，其中山奈酚糖苷類化合物(1，圖1)，經過結構優(yōu)化，在苷元3-羥基黃酮醇B環(huán)上引入羥基，同時用半乳糖修飾得到了對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌活性更好的先導化合物(2，圖1)[2]?；谇捌谘芯拷Y果，為了進一步探索3-羥基黃酮醇類抗菌活性-構效關系，設計合成了3-羥基黃酮醇B環(huán)三羥基取代半乳糖苷衍生物。由于多取代黃酮醇類化合物的制備方法受到取代羥基的影響較大，為了快速高效獲取一定量的化合物用于活性篩選，采用了以天然楊梅苷作為原料進行選擇性糖基化修飾策略。首先，利用天然楊梅苷(B環(huán)具有3個羥基取代)(4，圖2)作為原料，通過楊梅苷3-位糖基殘基可以對3-位形成天然的保護優(yōu)勢，經過芐基保護和直接酸解的方法脫除糖基殘基得到了3-位羥基游離的黃酮醇中間體5。然后，中間體5與α-溴代-2,3,4,6-四乙酰半乳糖苷糖苷反應制備得到全乙?；?半乳糖苷，緊接著在堿性條件下脫除乙?；玫街虚g體6。在酸性條件下，中間體6通過選擇性丙酮叉基保護半乳糖3′′,4′-二羥基，該中間體7可以直接通過?；磻獙Π肴樘?′,6′′-二羥基進行修飾，制備糖基選擇性修飾的化合物。最后，針對半乳糖2′′,6′′-二羥基修飾官能團的耐受性，通過不同的脫芐基保護策略和羥基脫保護制備相應的目標產物9和10，具體合成路線及反應條件如圖2所示。同時，中間體5的3-位游離羥基通過與不同的?；噭┓磻梢愿咝е苽?-羥基?；a物11，其制備方法和結構表征參考已報道方法[16]。

圖2 楊梅素糖苷類衍生物的合成路線Fig.2 Synthetic route of myricetin glycoside derivatives

通過以上方法，共計合成新型楊梅素糖苷化合物8個：9a-1～9a-5和10a-1～10a-3，其中在半乳糖2′′,6′′-位進行了不同取代的苯丙?；腿夤瘐；揎?；另外還有6個3-位羥基不同?；揎椀臈蠲匪匮苌?1a-1～11a-6。目標產物結構式如表1所示。

表1 合成的楊梅素糖苷類衍生物Tab.1 Synthetic myricetin glycoside derivatives

中間體5：5,7-雙(芐氧基)-3-羥基-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-4H-苯并吡喃酮

在反應瓶中加入楊梅苷37.1 g(80 mmol)，Cs2CO3156.5 g(480 mmol)及DMF(200 mL)，0.5 h內滴加溴芐58.0 mL(480 mmol)。氬氣保護下，室溫攪拌過夜。用EtOAc(300 mL)稀釋反應液后過濾，EtOAc(2×50 mL)洗滌、濾液用飽和氯化鈉洗(3×100 mL)、無水硫酸鈉干燥，過濾、減壓旋干得到紅棕色黏稠物。將上述紅棕色黏稠物溶解在i-PrOH(300 mL)中，加入HCl(3 mL)，加熱回流反應15 min后，有沉淀析出。繼續(xù)攪拌至原料反應完畢(LC-MS監(jiān)測)，過濾、EtOH(2×50 mL)洗滌，以EtOAc重結晶、干燥即得中間體5 46.7 g，淡黃色固體，收率為76%。m.p.172℃～174℃，ESI-MSm/z: 769.36 [M+H]+，C50H40O8，WM=768.27；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ 9.34 (s,1H),7.92-7.16 (m,27H),6.98 (s,1H),6.72 (s,1H),5.27 (s,4H),5.20 (s,4H),5.04 (s,2H)。

中間體6：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

在反應瓶中加入15.4 g中間體5(20 mmol)，加入200 mL干燥DMF，攪拌溶解后，加入9.8 g(30 mmol)Cs2CO3，0℃下攪拌反應10 min后，加入12.3 g(30 mmol)新制備的α-溴代-2,3,4,6-四乙?；肴樘擒眨?℃下繼續(xù)攪拌過夜，次日LC-MS監(jiān)測至反應完全，將反應液倒入500 mL冰水中，加入500 mLEtOAc萃取，然后以EtOAc(2×200 mL)再次萃取、合并有機相，水洗(3×500 mL)后，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾、減壓旋干得淡黃色黏稠物，加入200 mL THF溶解上述黏稠物，加入200 mL 10%NaOH溶液，常溫下繼續(xù)反應。LC-MS監(jiān)測反應完成后，將反應液倒入分液漏斗中，用EtOAc(3×50 mL)萃取、合并有機相，以飽和食鹽水(5×100 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾、減壓旋干得到淡黃色黏稠物，以二氯甲烷復溶后，100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE: EA=1:1)得中間體6 13.0 g，收率為70%。m.p.188～189℃,ESI-MSm/z: 931.27[M+H]+,C56H50O13,MW=930.33;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.70(s,2H),7.61 (d,J=7.5 Hz,2H),7.54 (d,J=7.3Hz,4H),7.51 (d,J=7.3 Hz,2H),7.37(m,17H),6.92 (d,J=2.1 Hz,1H),6.75 (d,J=2.1 Hz,1H),5.49 (d,J=7.8 Hz,1H),5.35(s,1H),5.26～4.98 (m,6H),5.18 (d,J=11.8 Hz,2H),5.05 (q,J=11.2 Hz,2H),4.89 (s,1H),4.64 (s,1H),4.54(s,1H),3.71 (s,1H),3.67 (t,J=8.6 Hz,1H),3.57 (dd,J=14.0,8.9 Hz,1H),3.45 (m,3H)。

中間體7：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-(3′,4′-O-異丙基)半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將11.4 g(12 mmol)中間體6、800 mgp-TsOH.H2O、14 g無水CaSO4及200 mL丙酮加入反應瓶中，攪拌24 h，TLC監(jiān)測反應完畢后，過濾除去CaSO4，濾液中加入少量Et3N終止反應，加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE: EA=2:1)得中間體7 9.6 g，收率為83%。m.p.196℃～197℃，ESI-MSm/z: 971.46[M+H]+,C59H54O13,MW=970.36;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ 7.70 (s,2H),7.61 (d,J=7.5 Hz,2H),7.51(d,J=7.3 Hz,6H),7.35(m,17H),6.92 (d,J=2.1 Hz,1H),6.76 (d,J=2.1 Hz,1H),5.64 (d,J=4.5 Hz,1H),5.52 (d,J=8.2 Hz,1H),5.25～5.22 (m,6H),5.14 (d,J=11.7 Hz,2H),5.05 (q,J=11.2 Hz,2H),4.78 (t,J=5.5 Hz,1H),4.14 (dd,J=5.5,1.7 Hz,1H),4.10 (m,1H),3.84 (m,1H),3.63 (t,J=11.2,5.6 Hz,1H),3.57 (m,1H),3.50 (t,J=7.6 Hz,1H),1.20 (d,6H) 。

中間體8a-1：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′,6′′-2-O-(3-氟肉桂酰基)-3′′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

將729 mg(0.75 mmol)化合物7、500 mg(3 mmol)間氟肉桂酸、1.2 g DCC(6 mmol)、360 mg(3 mmol)DMAP及20 mLCH2Cl2加入反應瓶中，室溫攪拌過夜，LC-MS監(jiān)測反應完成后，將反應液放置在-40℃低溫浴槽中，過濾除去固體后，加入0.5 mol/L的檸檬酸溶液(3×20 mL)洗滌，有固體析出，過濾除去，用0.5 mol/L的NaHCO3(3×20 mL)洗滌，水洗至中性后，放置-40℃低溫浴槽中，有固體析出，過濾除去，向濾液中加入100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2:MeOH=200:1)得粗產品，濃縮后用二氯甲烷溶解，用100～200目硅膠拌樣，柱層析分離純化(PE:EA=3:1)得533 mg中間體8a-1，收率為56%。m.p.137℃～138℃，ESI-MSm/z: 1267.84[M+H]+,C77H64F2O15,MW=1266.45;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.76～7.64 (m,3H),7.60 (d,J=16.1 Hz,1H),7.61～7.42 (m,5H),7.35～7.02 (m,31H),6.76 (d,J=16.0 Hz,1H),6.63 (d,J=7.9 Hz,2H),6.49 (d,J=16.0 Hz,1H),6.64～6.52 (m,3H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.98(m,11H),4.59～4.50 (m,1H),4.50 (s,1H),4.36 (d,J=9.0 Hz,1H),4.29 (d,J=6.8 Hz,2H),1.24 (s,6H)。

用此類方法可獲得中間體8a-2～8a-8。

化合物8a-2：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-甲基肉桂?；?-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為55%,m.p.170℃～171℃，ESI-MSm/z:1259.85 [M+H]+,C79H70O15,MW=1258.47;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.74 (d,J=15.9 Hz,1H),7.40～7.20 (m,36H),7.09 (d,J=7.8 Hz,2H),6.67 (d,J=5.9 Hz,2H),6.61 (d,J=16.0 Hz,1H),6.31 (d,J=16.0 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.89 (m,11H),4.49～4.34 (m,2H),4.31～4.20 (m,3H),2.31 (s,3H),2.21 (s,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-3：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-羥基基肉桂?；?-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為64%,m.p.131℃～132℃，ESI-MSm/z:1443.35 [M+H]+,C91H78O17,MW=1442.52;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.74 (d,J=15.8 Hz,1H),7.45～7.08 (m,42H),7.01 (d,J=8.7 Hz,2H),6.95 (d,J=8.5 Hz,2H),6.69 (s,1H),6.63 (s,1H),6.51 (d,J=15.9 Hz,1H),6.24 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.3 Hz,1H),5.11～4.86 (m,15H),4.52～4.34 (m,2H),4.34 (s,1H),4.27 (d,J=11.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-4：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3,4,5-三甲氧基肉桂?；?-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為56%,m.p.100℃～101℃，ESI-MSm/z:1411.71 [M+H]+,C83H78O21,MW=1410.51;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.66 (d,J=15.8 Hz,1H),7.43～7.11 (m,28H),7.03 (s,2H),6.82 (s,2H),6.69(d,J=15.9 Hz,1H),6.64 (s,1H),6.62 (s,1H),6.47 (d,J=15.9 Hz,1H),5.87 (d,J=8.3 Hz,1H),5.13～4.89 (m,11H),4.62～4.49 (m,1H),4.51～4.46 (m,1H),4.37 (s,1H),4.28 (d,J=11.4 Hz,2H),3.78 (s,6H),3.70 (s,6H),3.68 (s,3H),3.65 (d,J=8.3 Hz,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-5：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3,4,5-三羥基苯甲酰基)-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為31%,m.p.78℃～80℃，ESI-MSm/z:1815.67 [M+H]+,C115H98O21,MW=1814.66;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.60 (s,2H),7.33～7.12 (m,57H),7.11 (s,2H),6.61 (s,1H),6.48 (s,1H),5.96 (d,J=8.6 Hz,1H),5.32 (t,J=8.0 Hz,1H),5.08～4.86 (m,17H),4.77～4.68 (m,5H),4.67～4.62 (m,1H),4.60 (s,1H),4.49 (d,J=8.5 Hz,2H),4.40 (s,1H),1.28 (s,6H)。

化合物8a-6：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(4-三氟甲基肉桂?；?-3′,4′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為57%,m.p.101℃～102℃，ESI-MSm/z:1367.33 [M+H]+,C79H64F6O15,MW=1366.41;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.65～7.42 (m,8H),7.41～7.11(m,25H),6.94 (d,J=8.7 Hz,2H),6.86 (d,J=8.7 Hz,2H),6.65 (d,J=6.8 Hz,2H),6.51 (d,J=15.9 Hz,1H),6.24 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.5 Hz,1H),5.11～4.89 (m,11H),4.54～4.48 (m,2H),4.29～4,18 (m,3H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-7：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-氯肉桂酰基)-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為46%,m.p.101℃～102℃，ESI-MSm/z:1301.29 [M+H]+,C77H64Cl2O15,MW=1300.24;1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ 7.46～7.24 (m,37H),6.69 (d,J=16.1 Hz,1H),6.65 (m,2H),6.42 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.86 (m,11H),4.59～4.55(m,1H),4.52 (s,1H),4.36 (s,1H),4.29 (d,J=10.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

化合物8a-8：5,7-雙(芐氧基)-2-(3,4,5-三(芐氧基)苯基)-3-β-D-[2′′,6′-2-O-(4-溴肉桂?；?-3′′,4′′-O-異丙基半乳糖基]-4H-苯并吡喃酮

收率為57%，m.p.98℃～99℃，ESI-MSm/z:1387.85 [M+H]+,C77H64Br2O15,MW=1386.26;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6) δ 7.46～7.19 (m,37H),6.69 (d,J=16.1 Hz,1H),6.65～6.58 (m,2H),6.42 (d,J=15.9 Hz,1H),5.85 (d,J=8.4 Hz,1H),5.11～4.88 (m,11H),4.59～4.54 (m,1H),4.52 (s,1H),4.36 (s,1H),4.29 (d,J=10.5 Hz,2H),1.23 (s,6H)。

目標化合物9a-1：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氟苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將380 mg (0.3 mmol) 化合物8a-1、4 mL THF、2 mL CH3OH加入反應瓶中，加入200 μL 4 mol/L鹽酸-二氧六環(huán)溶液，室溫攪拌，TLC檢測反應至完全，加入幾滴三乙胺終止反應后，過濾，濾液加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2：CH3OH=100:1)得186 mg固體產物，收率為51%；取123 mg(0.1 mmol)所得化合物、20 mg 質量分數為10%的鈀碳、5 mL THF及2.5 mL CH3OH投入反應瓶中，室溫下常壓催化氫化過夜，LC-MS監(jiān)測反應至完全，采用0.25 μm有機膜過濾除去Pd-C，少量甲醇洗滌后，回收溶劑采用半制備高效液相(甲醇：水=75%:25%)純化得65 mg目標化合物9a-1，收率為73%。m.p.70～72℃,ESI-MSm/z: 781.19[M+H]+,C39H34F2O15,MW=780.19;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ 7.25 (s,2H),7.09 (ddJ=14.6,7.3 Hz,2H),6.96 (dd,J=7.7 Hz,2H),6.81～6.70 (m,4H),6.22 (s,1H),6.06(s,1H),5.42 (d,J=8.2 Hz,1H),5.30 (t,J=9.0 Hz,1H),4.25～4.22 (m,1H),4.08 (dd,J=11.5,4.2 Hz,1H),3.82(d,J=3.4 Hz,1H),3.75 (ddd,J=11.5,9.2,3.9 Hz,2H),2.92 (t,J=16.9 Hz,3H),2.78 (dt,J=15.3,7.6 Hz,1H),2.73～2.67 (m,1H),2.61 (td,J=7.5,3.1 Hz,2H),2.37 (t,J=7.8 Hz,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 179.4,174.8,174.4,166.2,165.6,163.7,163.4,158.7,158.5,146.8,145.3,145.1,138.5,135.8,131.6,131.5,131.4,125.8,125.6,122.3,116.7,116.5,116.3,114.4,114.2,110.4,106.2,102.3,100.2,95.0,75.0,74.4,73.2,71.0,64.9,37.0,36.9,32.0,31.8。

用此類方法可獲得目標化合物9a-2～9a-5。

化合物9a-2：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(4-甲基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為71%,m.p.70℃～72℃,ESI-MSm/z: 773.46[M+H]+,C41H40O15,MW=772.24;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.26 (s,2H),7.05 (d,J=7.6 Hz,2H),6.95 (d,J=7.6 Hz,2H),6.88～6.86 (m,4H),6.25 (d,J=1.7 Hz,1H),6.13 (s,1H),5.43 (d,J=8.0 Hz,1H),5.31 (dd,J=9.6,8.3 Hz,1H),4.21 (dd,J=11.5,7.9 Hz,1H),4.10(dd,J=11.5,4.3 Hz,1H),3.81 (d,J=3.4 Hz,1H),3.75(dd,J=9.8,3.4 Hz,1H),3.66 (dd,J=7.9,4.3 Hz,1H),2.90 (dd,J=12.8,7.1 Hz,2H),2.75～2.73 (m,2H),2.61(t,2H),2.38 (t,2H),2.24 (s,3H),2.11 (s,3H)；13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.8,173.8,173.5,166.5,158.2,158.1,157.9,151.0,150.8,150.7,150.5,150.4,150.3,148.2,140.2,136.8,136.6,136.4,136.3,132.6,132.2,130.7,130.6,125.7,125.6,124.5,124.4,124.3,124.2,117.0,111.0,75.2,74.9,73.6,70.7,37.9,37.2,31.3,31.2,21.4,21.3。

化合物9a-3：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(4-羥基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為78%,m.p.84℃～85℃,ESI-MSm/z: 777.20[M+H]+,C39H36O17,MW=776.20;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.27 (s,2H),7.02 (d,J=8.4 Hz,2H),6.84 (d,J=8.5 Hz,2H),6.61 (dd,J=8.5,6.6 Hz,4H),6.29 (d,J=2.1 Hz,1H),6.15 (d,J=2.1 Hz,1H),5.44 (d,J=8.1 Hz,1H),5.32 (dd,J=9.8,8.0 Hz,1H),4.22 (dd,J=11.5,7.9 Hz,1H),4.08 (dd,J=11.5,4.4 Hz,1H),3.82～3.78 (m,1H),3.75 (dd,J=9.8,3.4 Hz,2H),3.68～3.66 (m,1H),2.86(t,3H),2.71～2.69 (m,2H),2.57 (td,J=7.5,2.6 Hz,2H),2.36 (s,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.6,174.1,173.9,167.1,164.2,159.3,158.7,151.3,150.9,148.7,140.7,139.7,139.3,137.1,137.0,136.9,136.8,130.7,130.7,129.9,125.1,125.0,124.8,124.6,122.7,111.5,106.5,103.2,100.9,95.7,75.6,75.4,74.1,71.2,65.5,32.1,32.0,22.2,22.1。

化合物9a-4：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′,6′-2-O-(3?-(3,4,5-三甲氧基苯并?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為78%,m.p.72℃～73℃,ESI-MSm/z: 925.64[M+H]+,C45H48O21,MW=924.27;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.23 (s,2H),6.49 (s,2H),6.30 (s,2H),6.18 (d,J=1.8 Hz,4H),6.10 (d,J=1.7 Hz,1H),5.49 (d,J=8.1 Hz,1H),5.34 (m,1H),4.29～4.26 (m,1H),4.10 (dd,J=11.5,3.9 Hz,1H),3.85 (d,J=3.5 Hz,1H),3.79～3.76 (m,2H),3.74 (s,6H),3.72 (s,3H),3.69 (s,6H),3.54 (s,3H),2.94～2.92 (m,2H),2.78～2.76 (m,2H),2.56～2.53 (m,2H),2.39～2.36 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 177.8,173.5,173.4,166.5,163.5,158.7,158.1,154.6,150.8,150.6,150.4,148.2,140.2,138.0,137.9,137.7,136.5,136.3,136.1,132.2,130.0,124.5,124.4,124.2,124.1,122.1,110.9,106.8,106.0,102.9,100.3,95.1,75.2,74.8,73.6,70.7,65.2,61.3,61.2,37.5,37.0,32.3,31.2,21.4,21.1。

化合物9a-5：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′,6′-2-O-(3,,4,5-三羥基苯甲酰基))]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為77%,m.p.78℃～79℃,ESI-MSm/z: 785.51[M+H]+,C35H28O21,MW=784.11;1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ 7.25 (s,2H),7.15 (s,2H),6.95 (s,2H),6.29(d,J=2.1 Hz,4H),5.78 (d,J=8.0 Hz,1H),5.47 (dd,J=9.8,8.1 Hz,1H),4.42 (dd,J=11.1,6.8 Hz,1H),4.33(dd,J=11.1,6.3 Hz,1H),4.01 (d,J=3.1 Hz,1H),3.95 (t,J=6.6 Hz,1H),3.90 (dd,J=11.1,6.8 Hz,1H);13C NMR(126 MHz,CD3OD) δ 177.2,166.9,164.0,159.1,158.6,150.7,148.8,148.7,148.6,142.4,142.2,140.7,137.6 137.4,137.3,137.2,137.1,136.9,136.7,135.8,125.1,124.9,124.7,122.9,122.7,121.9,112.1,102.4,100.8,95.5,75.7,75.4,74.4,70.8,63.9。

目標化合物10a-1：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氟肉桂?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

將410 mg (0.3 mmol)化合物8a-6、4 mL四氫呋喃、2 mL甲醇加入反應瓶中，加入200 μL 4 mol/L鹽酸-二氧六環(huán)溶液，室溫攪拌，TLC檢測反應至完全，加入幾滴三乙胺終止反應后，過濾，濾液加入200～300目硅膠拌樣，柱層析分離純化(CH2Cl2:CH3OH=100:1)得131 mg固體產物，收率為33%；取63 mg (0.05 mmol)所得化合物及5 mL二氯甲烷投入反應瓶中，-78℃下用注射器滴加2 mL 1 mol/L BBr3的二氯甲烷溶液，反應液中有固體析出，LC-MS監(jiān)測反應完全后，加入3 mL甲醇終止反應，將反應液倒入冰水中，過濾得淡黃色固體，采用半制備高效液相純化(甲醇:水=75%:25%)得17 mg化合物10a-1，收率為46%。m.p.146℃～147℃,ESI-MSm/z: 877.57[M+H]+,C41H30F6O15,MW=876.15;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ 7.80～7.68 (m,3H),7.68～7.46 (m,4H),7.58～7.46(m,2H),7.47 (d,J=16.0 Hz,1H),7.22 (s,2H),6.77(d,J=16.1 Hz,1H),6.39 (d,J=16.0 Hz,1H),6.15 (s,1H),6.04 (s,1H),5.48～5.36 (m,2H),4.53 (dd,J=11.4,8.5 Hz,1H),4.24～4.20 (m,1H),3.94 (s,1H),3.88～3.80(m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ 177.8,166.6,166.5,165.9,163.1,158.2,157.7,149.9,147.8,143.2,139.8,139.1,138.8,136.1,135.9,135.7,135.4,133.4,131.8,129.6,129.2,129.1,126.3,126.0,124.1,124.0,123.8,123.6,122.5,121.6,110.5,105.5,99.9,94.6,75.1,73.4,70.5,65.9,64.9,31.2,31.1。用此類方法可獲得目標化合物10a-2～10a-3。

化合物10a-2：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-氯肉桂?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為49%,m.p.177℃～178℃,ESI-MSm/z:831.09 [M+Na]+,C39H30Cl2O15,MW=808.10;1H NMR(400 MHz,CD3OD) δ 7.73 (d,J=16.0 Hz,1H),7.59 (d,J=8.5 Hz,2H),7.39～7.26 (m,7H),7.22 (s,2H),6.64(d,J=16.0 Hz,1H),6.26 (d,J=16.0 Hz,1H),6.16 (d,J=1.9 Hz,1H),6.05 (d,J=1.9 Hz,1H),5.52 (d,J=8.0 Hz,1H),5.44～5.42 (m,1H),4.50 (dd,J=11.5,8.4 Hz,1H),4.23 (dd,J=11.6,4.0 Hz,1H),3.94 (d,J=3.2 Hz,1H),3.86～3.82 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 178.7,166.9,166.7,165.9 163.1,158.1,157.7,149.9,149.8,147.8,143.8,143.7,139.8,136.1,135.9,135.7,135.3,134.1,133.9,130.3,130.2,129.7,129.6,124.2,124.1,123.9,123.7,121.6,120.4,119.6 110.5,105.5,99.9,94.6,75.1,74.9,73.4,70.5,64.8。

化合物10a-3：2-(3,4,5-三羥基苯基)-5,7-二羥基-3-β-D-[2′′,6′′-2-O-(3?-(3-溴肉桂?；?)]半乳糖基-4H-苯并吡喃酮

收率為72%,m.p.172℃～173℃,ESI-MSm/z:919.99 [M+Na]+,C39H30Br2O15,MW=896.00;1H NMR(400 MHz,CD3OD) δ 7.73 (d,J=16.0 Hz,1H),7.60 (d,J=8.5 Hz,2H),7.39～7.26 (m,7H),7.22 (s,2H),6.64(d,J=16.0 Hz,1H),6.28 (d,J=16.0 Hz,1H),6.16 (d,J=1.9 Hz,1H),6.05 (d,J=1.9 Hz,1H),5.52 (d,J=8.0 Hz,1H),5.44～5.40 (m,1H),4.50 (dd,J=11.5,8.4 Hz,1H),4.23 (dd,J=11.6,4.0 Hz,1H),3.94 (d,J=3.1 Hz,1H),3.86～3.76 (m,2H);13C NMR (126 MHz,CD3OD)δ 177.7,166.8,166.4,164.2,161.5,156.6,149.9,149.8,145.1,143.9,143.4,136.7,135.8,135.5,135.2,134.1,133.8,133.6,133.2,131.8,131.7,130.3,130.2,129.6,129.4,124.1,120.4,118.5,117.7,108.5,104.3,100.9,98.4,93.2,73.5,72.9,71.7,69.4,63.1。

2.2 抗菌活性測試

采用微量肉湯稀釋法測定14個化合物最小抑菌濃度(MIC)，詳細參考美國國家臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)抗菌藥物敏感性試驗操作規(guī)程[17]。用MH肉湯配置化合物2倍工作濃度的母液，母液中化合物的濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。吸取100 μL的化合物母液加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中的第1至第12孔內，然后各孔加入100 μL含有受試菌液的MH肉湯，每孔總液量為200 μL?？變人幬锝K濃度依次分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06 μg/mL，菌液終濃度均為105CFU/mL。實驗對照藥物為左氧氟沙星，陽性對照組：孔內含有左氧氟沙星與菌液。菌對照組：孔內僅接種菌液，不含藥物。細菌培養(yǎng)在37℃孵育18～20 h后觀測結果，肉眼觀察或酶標儀測定A600值，以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為其最低抑菌濃度(MIC)。實驗中所用菌株為耐萬古霉素腸球菌ATCC51299、萬古霉素敏感腸球菌ATCC29212、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43330、甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌。

3 結果與討論

3.1 化合物合成

在楊梅苷的芐基保護實驗中，發(fā)現當K2CO3作為堿時，楊梅苷5-羥基無法發(fā)生芐基化反應?？赡茉蚴?位羥基與4位羰基形成分子內氫鍵造成5位羥基難以被芐基化。通過優(yōu)化發(fā)現，當選用Cs2CO3時，楊梅苷能夠以較好的產率實現完全芐基化。在脫除楊梅苷3位鼠李糖時，通過優(yōu)化在不同的醇溶液的反應條件發(fā)現，與常用的甲醇、乙醇相比，采用異丙醇作為溶劑時，反應更高效，反應時間短，產率高。

由于糖供體α-溴代-2,3,4,6-四乙?；肴樘擒辗磻钚愿?，但是不穩(wěn)定容易降解，實驗過程中我們采用現制現用的方法來降低糖基給體對糖苷化反應的影響。另外，由于糖基化的產物與3-羥基五芐基楊梅苷原料難于在TLC分離開來，為了更加高效準確地判斷糖苷化反應終點，本反應采用LC-MS 跟蹤反應。另外，由于糖苷化反應過程中，未反應完全的3-羥基五芐基楊梅素難于與糖苷化產物分離開來，我們將糖苷化反應產物直接堿性條件下脫乙?；┞冻鎏黔h(huán)的羥基后再分離純化，更加易于剔除糖苷化反應未反應完全的原料，同時減少了分離步驟，便于操作，易于純化。

3.2 化合物抗菌活性

根據CLSI指導原則的微量稀釋法，對新合成的14個化合物進行了抗菌活性測試，測試結果如表2所示。通過對抗菌活性MIC數據可以看出，14個化合物對于糞腸球菌的MIC大于128 μg/mL，無論是敏感還是耐藥菌株都無抗菌活性?；衔?a-1～9a-4和10a-1～10a-3對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌顯示出較好的抗菌活性，MIC值范圍為32～1 μg/mL。其中半乳糖苷類楊梅素衍生物9a-1對耐甲氧西林葡萄球菌ATCC43300的最小抑菌濃度達到1 μg/mL。當用苯甲酸?；揎棸肴樘?,4-位羥基時，化合物9a-5的抗菌活性完全消失。新型糖苷類楊梅素衍生物對耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌活性要稍強于敏感菌株，該現象在10a-1～10a-3中較為明顯，但是10a-1～10a-3抗菌活性整體都弱于衍生物9a-1～9a-4。另外，3位羥基?；苌镏?，僅有11a-1顯示出一定的抗菌活性，其他化合物抗菌活性無顯著改善?；衔?1a-1～11a-6對這金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性弱于上述糖苷類衍生物，進一步提示半乳糖苷元修飾3位羥基的重要性。通過以上研究結果證明，3位羥基是個重要活性修飾位點，可能對衍生物的抗菌活性起著重要作用。

表2 衍生物9a-1～9a-5、10a-1～10a-3、11a-1～11a-6和對照藥物對標準菌株的MIC值Tab.2 The MIC values of derivatives 9a-1～9a-5,10a-1～10a-3,11a-1～11a-6 and control drug against bacterial strains

4 結論

本研究以楊梅苷作為原料設計了新的合成路線，并對合成中的關鍵反應條件進行了優(yōu)化，構建了一條高效快捷的楊梅素衍生物的制備方法。以天然楊梅素作為母核，合成了14個楊梅素類衍生物，利用核磁和ESI-MS對其結構進行了表征。通過微量肉湯稀釋法，對化合物進行了抗菌活性測試，發(fā)現8個抗菌活性顯著提高的活性化合物?；衔?a-1～9a-4的對革蘭陽性菌抗菌菌活性較好，其中9a-1半乳糖苷類楊梅素衍生物對耐甲氧西林葡萄球菌ATCC43300的最小抑菌濃度達到1 μg/mL?；衔锏某醪交钚匝芯拷Y果顯示，黃酮醇3位羥基半乳糖修飾可以顯著提高楊梅素的抗菌活性，為進一步開展具有抗菌作用的楊梅素衍生物的研究提供了新的線索。