王月瑩 楊素梅 劉芳 劉曼莉 張志剛 楊曦亮 方偉,*

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064；2 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，武漢 430081)

真菌是植物病害的主要病原微生物，占比達(dá)到70%～80%[1]。植物真菌病害侵染能力強(qiáng)，發(fā)病迅速，往往導(dǎo)致植物減產(chǎn)甚至絕收。據(jù)統(tǒng)計(jì)，單對主要糧食如水稻、小麥和玉米，真菌病害就給全球農(nóng)業(yè)帶來每年600億美元的經(jīng)濟(jì)損失，如果能完全控制植物真菌病害，全球每年可多養(yǎng)活6億人[2]。隨著真菌自我進(jìn)化以及環(huán)境因素等，仍需要不斷研發(fā)新的抗菌藥物來保證全球糧食安全。在現(xiàn)代農(nóng)藥的研發(fā)過程中，活性天然產(chǎn)物發(fā)揮著不可替代的重要作用，至今超過60%的市場銷售農(nóng)業(yè)抗真菌藥物來源于天然產(chǎn)物或者天然產(chǎn)物母核結(jié)構(gòu)[3-4]。

隨著活性新穎、結(jié)構(gòu)獨(dú)特化合物發(fā)現(xiàn)越來越困難，特殊生境微生物如極端環(huán)境，海洋微生物和致病微生物等受到越來越多關(guān)注[5-7]。致病微生物特別是植物病原菌，在與宿主的長期相互作用，相互進(jìn)化的和影響下，可以代謝產(chǎn)生大量的活性化合物，具有極大的挖掘潛力[8]。在篩選農(nóng)業(yè)抗菌活性化合物研究中，從稗草病斑中分離得到一株真菌Neoascochyta argentinaHBERC H-82，搖瓶發(fā)酵后采用乙酸乙酯提取，抗菌活性測試表明乙酸乙酯提取物具有顯著的抗真菌活性，對乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離，共鑒定出6個化合物。對分離化合物進(jìn)行抗菌活性評價(jià)，部分化合物對于灰葡萄孢菌顯示抑菌活性，這為開發(fā)利用該菌株成為活菌制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE(500 MHz)核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm，J為Hz)(德國Bruker BioSpin公司)；Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)；Waters 2767高效液相制備儀(Waters 2525泵，2767自動收集系統(tǒng)，2996二極管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0)；色譜柱：Sunfire C18OBD制備柱(5 μm,19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛爾蘭)；柱色譜Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典)。提取分離用試劑石油醚，乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團(tuán)生產(chǎn)。青霉素(ampicillin，T0814L，99.27%)和鏈霉素(streptomycin sulfate，0060，720IU)購自上海陶素生化科技有限公司。放線菌酮(actidione)購自于Sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種分離于稗草[Echinochloa crusgalli(L.)Beauv]病斑(2020年5月采集于湖北省鄂州市郊外)，通過形態(tài)鑒定和18S rRNA編碼基因序列比對分析鑒定為Neoascochyta argentina(相似度為99.6%)，現(xiàn)菌種保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心(編號為NBERC-H82)。

大腸埃希菌(Escherichia coli，ATCC25922)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiaeWH13013)、豬鏈球菌(Streptococcus suis,SC19)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)譚臣教授課題組提供，病原菌分離于湖北省農(nóng)場病豬體內(nèi)。禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearumSchw.)，番茄尖鐮孢菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersiciSnyder et Hansen)，立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKühn)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分離于染病植物葉片或果實(shí)。

1.3 發(fā)酵與提取

從保藏斜面管中挑取菌株H-82，接于PDA培養(yǎng)皿(馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L)中，放置培養(yǎng)架上28℃恒溫培養(yǎng)6 d，將菌塊轉(zhuǎn)接于500 mL錐形瓶(含175 mL發(fā)酵液，麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物 6.25 g/L，酵母提取物1 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L)，28℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，最終獲得15 L發(fā)酵液。向每瓶發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并乙酸乙酯提取液，40℃減壓濃縮得到乙酸乙酯提取物。

1.4 分離

乙酸乙酯提取物經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，0:1，每個梯度洗脫200 mL)，合并相同部分得到6個組分(Fr.A～F)。Fr.B經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20柱層析，用甲醇洗脫分離得到4個部分(Fr.B1～B4)。Fr.B2通過制備型高效液相色譜(Pre-HPLC)以乙腈-0.2%乙酸水(0～25 min，60%～100%乙腈，24 mL/min)洗脫得到化合物2(1.4 mg，Rt 11.64 min)；Fr.B3通過Pre-HPLC經(jīng)乙腈-0.2%乙酸水(0～28 min，25%～100%乙腈，24 mL/min)梯度洗脫，分別得到化合物3(25.1 mg，Rt 19.60 min)和化合物4(1.4 mg，Rt 23.69 min)；Fr.B4通過Pre-HPLC以乙腈-0.2%水(0～30 min，30%～100%乙腈，24 mL/min)溶劑梯度洗脫化合物1(2.9 mg，Rt 8.33 min)。將Fr.C溶于甲醇后，用制備型高效液相色譜以乙腈-0.2%乙酸水(0～35 min，5%～100%乙腈，20 mL/min)梯度洗脫得到化合物5(3.7 mg，Rt 14.45 min)；Fr.F溶于甲醇后，用Pre-HPLC，以乙腈-水(0～25 min，20%～90%乙腈，24 mL/min)梯度洗脫，在13.62 min時(shí)得到化合物6(12.0 mg)。

1.5 化合物抗菌活性測定

將測試樣品用DMSO配置成10 mg/mL濃度的母液，用菌種培養(yǎng)基稀釋，使加入到96孔培養(yǎng)板最終濃度依次為100，50，25，12.5，6.25和3.12 mg/mL。將病原菌制成菌懸液濃度約為1×108CFU/mL，再將菌懸液稀釋后加入96孔培養(yǎng)板中(濃度約為1×106CFU/mL)，然后加入藥物濃液，每種藥物每株菌做3個重復(fù)，同時(shí)設(shè)陰性對照和陽性對照。抗細(xì)菌對照藥物選擇青霉素、鏈霉素，抗真菌對照藥物為放線菌酮。恒溫箱中放置培養(yǎng)一定時(shí)間后(細(xì)菌為37℃培養(yǎng)24 h，真菌為28℃培養(yǎng)72 h)，讀取結(jié)果。肉眼觀察微量稀釋孔中以無細(xì)菌生長現(xiàn)象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對該種細(xì)菌的藥物最小抑菌濃度(MIC)。平行操作3次，以3次結(jié)果的平均值為此藥對該細(xì)菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定(圖1)

圖1 化合物1～6結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structures of compounds 1～6

化合物1，白色粉末，ESI-MS:m/z287.1 [M-H]-。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.71(1H，s，H-1)，5.31(1H，dd，J=12.0，3.0 Hz，H-3)，4.99(1H，d，J=12.0 Hz，H-3)，6.32(1H，d，J=1.5 Hz，H-4)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.15(2H，s，H-10，12)，2.15(3H，s，H-14)，3.72(3H，s，H-15)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 79.5(C-1)，74.4(C-3)，143.1(C-3a)，98.1(C-4)，162.8(C-5)，101.7(C-6)，153.5(C-7)，120.3(C-7a)，111.5(C-8)，157.2(C-9，13)，109.3(C-10，12)，140.3(C-11)，21.4(C-14)，55.9(C-15)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致，故化合物被鑒定為ascomfuran A。

化合物2，白色粉末，ESI-MS:m/z509.4 [M+H]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ 2.00(1H，m，H-1a)，1.13(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.84(1H，m，H-2b)，4.79(1H，m，H-3)，1.54(1H，m，H-5)，1.72(2H，m，H-6)，2.19(1H，t，J=5.5 Hz，H-7a)，1.72(1H，m，H-7b)，1.65(1H，dd，J=9.0，3.0 Hz，H-9)，2.49(1H，m，H-11a)，2.26(1H，m，H-11b)，6.56(1H，s，H-14)，1.05(3H，s，H-17)，1.30(3H，s，H-18)，0.91(3H，s，H-19)，3.87(1H，d，J=8.5 Hz，H-20a)，3.84(1H，d，J=8.5 Hz，H-20b)，2.02(3H，s，3-OAc)，2.04(3H，s，20-OAc)，7.84(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.9(C-1)，23.8(C-2)，75.3(C-3)，41.9(C-4)，48.2(C-5)，20.0(C-6)，41.1(C-7)，82.1(C-8)，52.7(C-9)，36.5(C-10)，18.1(C-11)，100.3(C-12)，165.5(C-13)，99.8(C-14)，159.8(C-15)，166.6(C-16)，16.9(C-17)，20.7(C-18)，13.3(C-19)，66.0(C-20)，172.4(3-O-CO-CH3)，21.0(3-O-COCH3)，172.6(20-O-CO-CH3)，20.9(20-O-CO-CH3)，132.6(C-1′)，126.4(C-2′，6′)，130.1(C-3′，5′)，131.8(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道化合物[10]核磁數(shù)據(jù)一致，故化合物被鑒定為phenylpyropene B。

化合物3，白色粉末，ESI-MS:m/z451.4[M+H]+。1H NMR(500 MHz，CD3Cl)δ 1.81(1H，m，H-1a)，1.18(1H，td，J=13，3.5 Hz，H-1b)，1.73(1H，m，H-2a)，1.69(1H，m，H-2b)，4.50(1H，dd，J=12.0，5.0 Hz，H-3)，1.09(1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-5)，1.81(2H，m，H-6)，2.13(1H，J=13.0，2.5 Hz，H-7a)，1.70(1H，m，H-7b)，1.51(1H，dd，J=13.0，4.5 Hz，H-9)，2.51(1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-11a)，2.22(1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-11b)，6.36(1H，s，H-14)，1.26(3H，s，H-17)，0.90(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-20)，2.06(3H，s，3-OAc)，7.78(2H，m，H-2′，6′)，7.42(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3Cl)δ 37.3(C-1)，23.6(C-2)，80.3(C-3)，37.9(C-4)，55.2(C-5)，19.4(C-6)，40.4(C-7)，80.7(C-8)，51.6(C-9)，36.9(C-10)，17.4(C-11)，99.5(C-12)，163.4(C-13)，98.4(C-14)，158.3(C-15)，164.7(C-16)，28.2(C-17)，20.8(C-18)，16.8(C-19)，15.3(C-20)，171.0(3-O-CO-CH3)，21.4(3-O-CO-CH3)，131.6(C-1′)，125.5(C-2′，6′)，129.0(C-3′，5′)，130.6(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道化合物[11]數(shù)據(jù)一致，故化合物被鑒定為phenylpyropene C。

化合物4，白色粉末，ESI-MS:m/z489.3[M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 1.81(1H，m，H-1a)，1.13(1H，m，H-1b)，1.72(1H，m，H-2a)，1.68(1H，m，H-2b)，4.52(1H，dd，J=8.5，3.5 Hz，H-3)，1.13(1H，d，J=4.0 Hz，H-5)，1.81(2H，m，H-6)，2.13(1H，m，H-7a)，1.70(1H，m，H-7b)，1.51(1H，d，J=4.0 Hz，H-9)，4.95(1H，d，J=2.5 Hz，H-11)，6.65(1H，s，H-14)，1.41(3H，s，H-17)，1.68(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-20)，2.04(3H，s，3-OAc)，7.85(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 36.5(C-1)，24.4(C-2)，82.0(C-3)，38.8(C-4)，56.7(C-5)，20.6(C-6)，42.9(C-7)，83.3(C-8)，57.1(C-9)，37.7(C-10)，60.5(C-11)，103.6(C-12)，165.4(C-13)，99.7(C-14)，161.0(C-15)，166.1(C-16)，28.4(C-17)，22.8(C-18)，17.5(C-19)，17.0(C-20)，172.8(3-O-COCH3)，21.1(3-O-CO-CH3)，132.5(C-1′)，126.5(C-2′，6′)，130.0(C-3′，5′)，132.1(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道化合物[12]數(shù)據(jù)一致，故化合物被鑒定為phenylpyropene F。

化合物5，白色粉末，ESI-MS:m/z605.3[M+Na]+。1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 1.92(1H，m，H-1a)，1.44(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.85(1H，m，H-2b)，4.81(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，1.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-5)，1.70(2H，m，H-6)，4.99(1H，m，H-7)，1.44(1H，m，H-9)，4.97(1H，m，H-11)，6.65(1H，s，H-14)，1.49(3H，s，H-17)，1.75(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，3.80(1H，d，J=12.0 Hz，H-20a)，3.75(1H，d，J=12.0 Hz，H-20b)，2.06(3H，s，3-OAc)，2.13(3H，s，7-OAc)，2.03(3H，s，20-OAc)，7.86(2H，m，H-2′，6′)，7.48(3H，m，H-3′，4′，5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.1(C-1)，23.9(C-2)，75.3(C-3)，41.7(C-4)，46.6(C-5)，26.1(C-6)，79.9(C-7)，84.3(C-8)，55.6(C-9)，39.1(C-10)，60.3(C-11)，103.6(C-12)，164.1(C-13)，99.4(C-14)，161.2(C-15)，165.8(C-16)，17.9(C-17)，16.8(C-18)，13.5(C-19)，66.0(C-20)，172.6(3-O-CO-CH3)，21.0(3-O-COCH3)，172.4(7-O-CO-CH3)，21.1(7-O-CO-CH3)，172.0(20-O-CO-CH3)，20.7(20-O-CO-CH3)，132.5(C-1′)，126.6(C-2′，6′)，130.0(C-3′，5′)，132.1(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道化合物[10]數(shù)據(jù)一致，故化合物被鑒定為phenylpyropene A。

化合物6，ESI-MS:m/z584.4 [M+H]+。白色粉末，1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ 2.18(1H，m，H-1a)，1.44(1H，m，H-1b)，2.15(1H，m，H-2a)，1.87(1H，m，H-2b)，4.81(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz，H-3)，1.62(1H，d，J=5.0 Hz，H-5)，1.74(1H，m，H-6a)，1.68(1H，m，H-6b)，4.99(1H，m，H-7)，1.62(1H，d，J=5.0 Hz，H-9)，4.99(1H，m，H-11)，6.82(1H，s，H-14)，1.49(3H，s，H-17)，1.75(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，3.80(1H，d，J=12.0 Hz，H-20a)，3.75(1H，d，J=12.0 Hz，H-20b)，2.07(3H，s，3-OAc)，2.13(3H，s，7-OAc)，2.03(3H，s，20-OAc)，9.04(1H，d，J=1.5 Hz，H-2′)，8.63(1H，dd，J=5.0，1.5 Hz，H-4′)，7.56(1H，dd，J=8.0，5.0 Hz，H-5′)，8.29(1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-5′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ 37.1(C-1)，23.8(C-2)，75.3(C-3)，41.7(C-4)，46.6(C-5)，26.1(C-6)，79.8(C-7)，84.5(C-8)，55.5(C-9)，39.1(C-10)，60.3(C-11)，105.5(C-12)，164.1(C-13)，101.0(C-14)，158.2(C-15)，165.1(C-16)，17.9(C-17)，16.8(C-18)，13.5(C-19)，66.0(C-20)，171.0(3-O-CO-CH3)，21.4(3-O-COCH3)，172.0(7-O-CO-CH3)，21.1(7-O-CO-CH3)，172.6(20-O-CO-CH3)，20.7(20-O-CO-CH3)，129.0(C-1′)，147.3(C-2′)，151.8(C-4′)，125.5(C-5′)，129.05(C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道化合物[13]數(shù)據(jù)一致，故化合物被鑒定為pyripyropene A。

2.2 化合物抗菌活性

化合物1～6最高濃度(100 μg/mL)對測試細(xì)菌菌株均未顯示出活性?；衔?～6對于測試的4種真菌菌株活性結(jié)果見表1?；衔?，2，4和5對于灰葡萄孢菌具有中等效果的抑制活性(MIC均為50 μg/mL)，化合物6具有較弱的抑制活性(MIC為100 μg/mL)，所有活性化合物只針對灰葡萄孢菌顯示抑制活性。

表1 化合物1～6對植物病原真菌最小抑菌濃度(MIC μg/mL)Tab.1 The MIC (μg/mL) of compounds 1～6 for phytopathogenic fungi

3 討論與結(jié)論

Pyripyropene系列物質(zhì)是從煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中分離得到的雜萜類天然化合物，具有良好的特異性抑制膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)活性[13-15]。在篩選殺蟲活性化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)pyripyropene A對刺吸式害蟲如蚜蟲具有良好的活性，并且顯示出獨(dú)特的藥理作用[16]。經(jīng)過大量的結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)化合物的C-3，C-7，C-20位為關(guān)鍵的活性位點(diǎn)，當(dāng)C-3，C-20位由乙?；?yōu)榄h(huán)丙甲?；?，C-7位為羥基時(shí)，活性提高約80倍，該化合物被命名為雙丙環(huán)蟲酯(afidopyropen)，并成功上市銷售[17-18]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)pyripyropene類化合物具有抗真菌活性，C-15位為苯基時(shí)活性要優(yōu)于吡啶基團(tuán)，這與殺蟲活性的結(jié)果不一致[19]；C-7位取代對于抗真菌活性沒有影響，不是活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。另外，這一類化合物特異性只針對灰葡萄孢菌有活性，表明其可能具有獨(dú)特的作用機(jī)理[19]。植物毒性測試時(shí)，200 μg/mL濃度的化合物5和6對于植物(擬南芥、稗草、馬唐和反枝莧)種子的萌發(fā)和生長沒有影響(結(jié)果未列出)。深入研究pyripyropene類化合物抗真菌活性的構(gòu)效關(guān)系以及作用機(jī)理可以為新的抗真菌先導(dǎo)化合物提供理論依據(jù)。

在篩選抗真菌活性菌種時(shí)，H-82發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物顯示具有良好的抑制灰葡萄孢菌活性(5 mL發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物溶解到1 mL乙醇中，將乙醇溶液稀釋100倍后仍具有抑制活性)，根據(jù)化合物活性測試結(jié)果分析，可能分離到化合物存在協(xié)同作用或者有顯著活性化合物沒有被分離到。本次研究分離化合物均首次從Neoascochyta屬分離得到，也是首次從青霉屬Penicillium和曲霉屬Aspergillus以外類群發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生pyripyropene類化合物，為pyripyropene類化合物生產(chǎn)提供菌種資源；并且首次發(fā)現(xiàn)pyripyropene類化合物具有抑制灰葡萄孢菌的活性，在應(yīng)用該真菌作為活菌制劑時(shí)，可能對農(nóng)作物起到殺蟲和殺菌的雙重保護(hù)功效。