劉蘭 劉潺 加明明 萬璐 吳小軍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430060)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是常見的機會性病原體，會引起肺炎、尿路感染、以及嚴(yán)重的血流感染[1]。常規(guī)的治療方式是采用碳青霉烯類抗生素，例如亞胺培南、美羅培南等，但是隨著抗生素的濫用和耐藥性的擴散，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌已經(jīng)在全球廣泛分布，部分菌株甚至具有多重耐藥性[2-4]。因此，尋求抗生素以外的細(xì)菌病治療方式是當(dāng)務(wù)之急。

噬菌體是特異性侵染細(xì)菌的病毒，且廣泛存在于自然界，是細(xì)菌的“天敵”。與抗生素相比，噬菌體具有研發(fā)快、特異性強、避免殺滅人體益生菌群以及對人體毒性低等優(yōu)勢，因此面對多重耐藥菌的威脅，噬菌體療法的研究和應(yīng)用已經(jīng)成為當(dāng)今的熱點，具有良好的發(fā)展前景[5]。

本研究以具有β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性，產(chǎn)SHV-18型ESBLs的標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌K.pneumoniaeATCC700603[6]為宿主菌，從某醫(yī)院的污水中分離鑒定出了一株裂解性噬菌體，命名為P1，并對其裂解譜，最佳感染復(fù)數(shù)和熱穩(wěn)定性等生物學(xué)特性和基因組信息進行了研究和分析，確定P1為一株全新發(fā)現(xiàn)的噬菌體。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

宿主菌K.pneumoniaeATCC700603，實驗用菌株Escherichia coliMG1655，Staphylococcus aureusRN4220和Pseudomonas aeruginosaPAO1均為實驗室存儲。臨床菌株K.pneumoniae2-21來源于武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，從血流感染患者感染血液分離而來；裂解性噬菌體分離自武漢大學(xué)人民醫(yī)院附近的污水。所有K.pneumoniae菌株均在添加了100 μg/mL 氨芐西林的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中37℃過夜震蕩培養(yǎng)，其它菌株在不添加抗生素的LB培養(yǎng)基中37℃過夜震蕩培養(yǎng)。

1.2 噬菌體的分離純化和收集

該步驟全部采用雙層平板法。將過夜培養(yǎng)的K.pneumoniaeATCC700603菌液、0.22 μm濾膜過濾后的醫(yī)院污水和3×LB培養(yǎng)基等體積混合，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。離心、0.22 μm濾膜過濾培養(yǎng)液上清后保留濾液。

制備LB固體下層平板(1.5%瓊脂)，在半固體LB培養(yǎng)基(0.7%瓊脂)中混合20 μL過夜培養(yǎng)的K.pneumoniaeATCC700603菌液和10 μL培養(yǎng)液濾液后平鋪為上層平板。37℃培養(yǎng)過夜后可看到宿主菌背景之上的透明圓形噬菌斑。

挑取單噬菌斑懸浮于SM buffer (NaCl，MgSO4，Tris-HCl pH7.5，2%glutin) 后再次與K.pneumoniaeATCC700603菌液混合制備雙層平板以進行進一步純化，進行3輪“挑取噬菌斑-懸浮-鋪雙層LB平板”的循環(huán)。

收集噬菌體前，在上層平板滴加3～4 mL SM buffer，室溫下孵育2 h。輕刮下含噬菌斑的上層半固體平板，在SM buffer中搗碎。4℃，5000 r/min離心30 min后收集上清，用0.22 μm無菌濾器過濾上清，收集濾液并保存。

1.3 噬菌體裂解譜分析

分別以肺炎克雷伯菌臨床菌株K.pneumoniae2-21、大腸埃希菌E.coliMG1655、金黃色葡萄球菌S.aureusRN4220以及銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1的穩(wěn)定期菌液作為宿主，與P1混合后利用雙層平板法測試P1的裂解譜，觀察是否有噬菌斑產(chǎn)生。有噬菌斑出現(xiàn)視為有裂解性，無噬菌斑視為無裂解性。

1.4 最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)測試

參照文獻[7]進行，噬菌體與宿主菌的比值(MOI) 分別為0.01、0.1、1、10和100混合后用雙層平板培養(yǎng)過夜，計噬菌體PFU，得到噬菌體滴度最高的MOI即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.5 噬菌體熱穩(wěn)定性試驗

分別在室溫(room temperature,RT)、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃條件下處理噬菌體并開始計時，分別在20、40和60 min取樣，用雙層平板法計算噬菌體滴度。

1.6 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察

將封口膜平鋪于冰盒上冷卻，將20 μL噬菌體原液滴在封口膜上，將銅網(wǎng)浸入噬菌體原液中，15 min后用濾紙吸除銅網(wǎng)上多余的液體，滴加適量的2%磷鎢酸(PTA)溶液，染色10 min后用濾紙吸干，放置于濾紙上，在陰涼處自然干燥后使用透射電子顯微鏡進行觀察。并按照國際病毒分類委員會(ICTV)第九次病毒分類報告，對噬菌體形態(tài)進行鑒定和分類。

1.7 噬菌體基因組提取、測序和生物信息學(xué)分析

將噬菌體P1與宿主菌共培養(yǎng)以進行噬菌體的擴增，5000 r/min離心30 min后取上清，用0.22 μm無菌濾器過濾，保留濾液。加入DNaes I(1 μg/mL)在37℃下消化4 h，以降解宿主DNA。加入0.5 mol/L EDTA，65℃放置30 min以失活DNase I。冷卻至室溫后加入蛋白酶K(50 μg/mL)，在56℃孵育1 h以裂解噬菌體蛋白衣殼。進行酚氯仿抽提步驟以除去蛋白，保留DNA。得到的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測是否降解，同時用宿主基因組匹配引物對得到的產(chǎn)物進行PCR以檢測噬菌體基因組污染情況。

DNA文庫構(gòu)建使用Vazyme公司的TruePrep Index Kit V3 for Illumina進行，具體操作參照產(chǎn)品說明，用Qubit蛋白核酸定量儀對DNA文庫樣品量進行檢測。使用Illumina平臺X-ten進行測序，二代測序由安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司完成。測序結(jié)果的分析分別使用FastqC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和Trim galore (https://www.encodeproject.org/software/trim_galore/)進行質(zhì)控和低質(zhì)量reads去除；分別使用megahit (http://www.l3-bioinfo.com/products/megahit.html)[8]和RAST (http://rast.nmpdr.org/)[9]進行基因組組裝和注釋，基因組數(shù)據(jù)已提交至NCBI，獲取序列號MZ598515。使用NCBI在線BLAST功能進行同源序列比對，應(yīng)用MEGA-X software(https://www.megasoftware.net/)[10]構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離鑒定

本研究以肺炎克雷伯菌ATCC700603為宿主菌，經(jīng)過雙層平板法多次純化后，從污水中分離到一株裂解性噬菌體，命名為P1，P1擁有直徑為2～5 mm的噬菌斑，有明顯的暈環(huán)(圖1)。

圖1 噬菌體P1形成的噬菌斑Fig.1 Plaque of P1

2.2 裂解譜

P1無法裂解肺炎克雷伯菌臨床菌株K.pneumoniae2-21、大腸埃希菌E.coliMG1655、金黃色葡萄球菌S.aureusRN4220以及銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1，說明P1具有強特異性(圖2和表1)。

表1 噬菌體P1裂解譜Tab.1 The host range of phage P1

圖2 噬菌體P1裂解譜測試Fig.2 Test of lysis range of P1

2.3 噬菌體生物學(xué)性質(zhì)的測定

本研究得知噬菌體P1在MOI=10時達到最高滴度，即最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10(表2)。

表2 噬菌體P1的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測定Tab.2 Determination of optimal multiplicity of infection (MOI)of P1

本研究測試了噬菌體P1在不同溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明P1耐受50℃及以下溫度，在60℃及以上溫度處理下穩(wěn)定性明顯降低，在70℃及以上處理時20 min即可看到噬菌體穩(wěn)定性驟降(圖3)。

圖3 噬菌體P1熱穩(wěn)定性Fig.3 Resistance of P1 to temperature

2.4 噬菌體形態(tài)的電鏡觀察

經(jīng)透射電鏡觀察，噬菌體P1擁有一個典型的二十面體頭部結(jié)構(gòu)以及一個不可伸縮的尾絲結(jié)構(gòu)。二十面體頭部直徑大約為55～60 nm，尾絲長度約為150～155 nm。根據(jù)ICTV第九次報告，P1應(yīng)該被歸類為有尾體目，長尾噬菌體科(圖4)。

圖4 噬菌體P1透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 Transmission electron micrographs of phage P1

2.5 全基因組測序及結(jié)果分析

2.5.1 全基因組概述

二代測序結(jié)果顯示，噬菌體P1基因組含50675 bp DNA，GC含量為50.88%，預(yù)測到82個編碼序列(CDS)。經(jīng)NCBI比對，與噬菌體P1的全基因組序列最相近的是Klebsiellaphage KOX1[11]，具有97.18%的一致性和89%的覆蓋率。

2.5.2 基因功能預(yù)測

在82個分析到的CDS中，50個為功能未知的假設(shè)蛋白，32個為可預(yù)測到蛋白功能的CDS，包含了噬菌體頭部/衣殼蛋白、尾部蛋白、DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白等(表3)。

表3 噬菌體P1的ORF功能預(yù)測(不含假設(shè)蛋白)Tab.3 Prediction of ORF function of phage P1 (without hypothetical protein)

2.5.3 序列比對與的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步研究噬菌體P1的進化關(guān)系以及了解宿主特異性與噬菌體尾絲蛋白基因序列的關(guān)系，基于噬菌體保守的末端酶大亞基(ORF 2)與尾絲蛋白蛋白序列構(gòu)建進化樹(圖5A)，進化分析結(jié)果表明噬菌體P1與克雷伯菌噬菌體KOX1、PKP126、LF20、P528等具有更近的親緣性。而尾絲蛋白序列同源性最高的為克雷伯菌噬菌體LF20、PKP126、KLPN1、KOX1(圖5B)。

圖5 噬菌體P1進化樹Fig.5 Phylogenetic analyses of phage P1 and homologous phages.

3 討論

從1980年以來，人類很少發(fā)現(xiàn)新的抗生素種類，世衛(wèi)組織在2017年確認(rèn)并宣布當(dāng)今世界抗生素瀕臨枯竭，細(xì)菌耐藥將成為人類健康最大的威脅之一。在全世界范圍內(nèi)，“ESKAPE”病原體，即致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌是院內(nèi)耐藥細(xì)菌感染的代表。在此背景下，噬菌體治療理論與應(yīng)用研究的輝煌時代應(yīng)運而生[5]，噬菌體是細(xì)菌的“天敵”，除了研發(fā)新的抗菌藥物以外，尋找自然界中對應(yīng)的噬菌體攻克耐藥細(xì)菌從而與耐藥菌的進化“賽跑”同樣為一種好的思路。目前，國內(nèi)對于“ESKAPE”病原體的噬菌體分離鑒定、功能及基因組學(xué)研究等已取得了不菲的成果[7,12-16]。

肺炎克雷伯菌作為腸桿菌科的一員，是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的常見病原體，可引起多種感染，特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯類超強毒力克雷伯菌(CR-hvKP)的出現(xiàn)給肺炎克雷伯菌感染的治療帶來了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[17]，此外，肺炎克雷伯菌莢膜血清型的多樣化(至少79種)也大大增加了治療的復(fù)雜性，進一步限制了抗生素治療的選擇性，因此，尋找肺炎克雷伯耐藥菌株感染的替代治療方法勢在必行。已有研究報道，應(yīng)用一株新型噬菌體(PKP2)聯(lián)合慶大霉素可有效治療肺炎克雷伯菌感染的小鼠，聯(lián)合治療組小鼠不僅全部存活，而且肺部的病理改變和炎癥因子均恢復(fù)到正常水平，療效優(yōu)于慶大霉素單藥治療[18]。

本研究分離到的肺炎克雷伯菌裂解噬菌體P1在最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10時的一步生長曲線顯示出較短的潛伏期和較大的裂解量，表明其具有較強的裂解性質(zhì)。且在40℃和50℃時存活率保持在較高水平，這與之前許多研究報道的噬菌體最適溫度相似[14]?；蚪MBLAST結(jié)果表明，除與Klebsiellaphage KOX1具有較高的相似性外(97.18%的一致性和89%的覆蓋率)，P1基因組與NCBI發(fā)表的其他噬菌體基因組相似性較低，這也提示可以將這些噬菌體的研究與噬菌體P1結(jié)合起來，分析它們在基因組中的共性和差異，這樣不僅可以更深入地了解噬菌體P1，更重要的是挖掘出目前未知的信息。

尾絲蛋白作為噬菌體特異性識別宿主的物質(zhì)基礎(chǔ)，決定了噬菌體的宿主范圍，在這次研究中，挑選的部分臨床菌株均無法被噬菌體P1特異性吸附裂解，這可能和噬菌體往往具有嚴(yán)格的宿主特異性有關(guān)，且噬菌體P1尾絲蛋白同源序列比對結(jié)果也進一步說明了其具有很強的宿主特異性。而其對肺炎克雷伯菌ATCC700603(分離自院內(nèi)感染患者尿液，莢膜血清型為K6，具有編碼ESBLs基因bla-SHV-18的質(zhì)粒)的裂解特異性填補了針對K6血清型肺炎克雷伯菌感染的噬菌體文庫的空白，也為后續(xù)的噬菌體-抗生素聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)，在未來，P1有望成為K6血清型肺炎克雷伯菌感染的治療劑。值得注意的是，基因測序分析表明，該噬菌體未見已知毒素基因，這也為今后噬菌體應(yīng)用于臨床治療提供了安全保障。

4 結(jié)論

本研究從醫(yī)院的污水中成功分離出一株新型肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體，經(jīng)電鏡觀察，屬于典型的有尾噬菌體，命名為“P1”，并進一步研究了裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、全基因組及基因功能的特性，為肺炎克雷伯菌的噬菌體治療提供理論基礎(chǔ)和噬菌體儲備。除此之外，噬菌體P1的噬菌斑所形成的暈環(huán)大、圓，暈環(huán)內(nèi)的宿主特性值得進一步研究。加快對新型噬菌體的分離鑒定和基因組測序研究，明確噬菌體與宿主菌之間的相互作用機制對未來抗生素替代療法的發(fā)展意義重大。