鄭茂 袁成良 鄂建飛 鄒玉

(1 德陽市人民醫(yī)院檢驗科，德陽 618000；2 德陽市人民醫(yī)院輸血科，德陽 618000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是引起醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染的重要潛在病原體，也是近年來腸桿菌目中僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌。20世紀80年代，首次報道肺炎克雷伯菌的一個新變種，引發(fā)無膽道疾病的患者發(fā)生侵襲性肝膿腫，并伴有轉(zhuǎn)移性眼內(nèi)炎，該變種被定義為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)，此后世界范圍內(nèi)相繼報道類似感染病例，在中國、新加坡、韓國、日本等亞太地區(qū)尤為常見，成為一種公共衛(wèi)生安全的新威脅[1]。與引起醫(yī)院獲得性感染的經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiella pneumoniae,cKP)不同，hvKP的典型特征是傾向于感染無基礎(chǔ)疾病的年輕機體，導(dǎo)致肝膿腫、肺炎、眼內(nèi)炎、腦膜炎等嚴重疾病，亦可繼發(fā)遷徙性播散而出現(xiàn)多器官癥狀，嚴重者甚至危及生命[2-3]。令人擔(dān)憂的是，相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示hvKP的流行病學(xué)發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變，可能正在取代cKP成為醫(yī)院和醫(yī)療保健相關(guān)感染的主要致病類型[4]。傳統(tǒng)觀點認為，肺炎克雷伯菌的高毒力和多重耐藥在基因組上幾乎沒有重疊，故大部分hvKP對除氨芐西林外的常用抗生素都保持高度敏感[5]。然而，隨著抗生素的不斷選擇以及耐藥質(zhì)粒的傳播，hvKP耐藥率呈連年升高趨勢，甚至出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥株(carbpenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CRhvKP)，給臨床抗感染治療帶來極大阻礙[6-7]。

盡管有大量與hvKP相關(guān)的文獻報道，但國際上仍無統(tǒng)一的hvKP定義標準[8]。已報道的研究使用各種評價標準，如拉絲試驗陽性、特定的莢膜血清型或毒力基因，亦有基于臨床表現(xiàn)結(jié)合病原菌分離來定義hvKP[9]。這使得不同研究數(shù)據(jù)之間可能難以解釋和比較?；诹餍胁W(xué)分析和感染的快速診斷等多方需求，目前迫切需要關(guān)于hvKP的準確表征或客觀鑒定方法，為此，本文就hvKP的實驗室鑒定方法進行如下綜述。

1 hvKP的表型鑒定

1.1 高黏性表型

hvKP常表現(xiàn)為高黏性表型，即菌落在血平板上生長呈高黏液性，這種高黏性能是hvKP抵抗中性粒細胞吞噬和宿主細胞免疫殺傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，與其高毒力特征密切相關(guān)。因此，在某些較早文獻中hvKP又被稱為高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae，hmKP)。高黏性表型可通過黏液拉絲試驗(string test)來初步判斷，將菌株接種于血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16～18 h，用接種環(huán)輕柔向上挑起菌落，重復(fù)兩次，若挑起的黏液絲長度≥5 mm，即為拉絲試驗陽性，稱菌株為高黏性表型。拉絲試驗是一種半定量試驗，無需特殊儀器，操作簡便，結(jié)果易于判斷，故以往研究常將拉絲試驗作為hvKP的篩選試驗。

Tan等[10]研究發(fā)現(xiàn)在鑒定與原發(fā)性肝膿腫相關(guān)的肺炎克雷伯菌菌血癥分離株中，拉絲試驗重復(fù)性超過95%，根據(jù)拉絲長度截斷值不同(5、10和15mm)，靈敏度和特異度分別介于66%～90%、64%～67%，但是陽性預(yù)測值小于35%。另一項來自日本的橫斷面研究顯示[11]，采用拉絲試驗鑒定引起血流感染的hvKP，靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為69.2%、89.5%、60.0%和92.7%。由此可見，拉絲試驗雖然操作簡單，但鑒定hvKP的陽性預(yù)測值卻不高，可能造成hvKP漏檢，給臨床感染控制帶來困難，尤其不適合作為hvKP低流行地區(qū)的確定性試驗。隨著研究深入，新的證據(jù)表明高黏性和高毒力是肺炎克雷伯菌兩種不同的表型，雖然有很多相似之處卻不能完全等同，即hvKP不一定具有高黏性，高黏液性肺炎克雷伯菌也不一定具有高毒力[12]。所以僅憑拉絲試驗陽性來鑒定hvKP并不十分可靠，有必要識別高毒力表型背后的遺傳決定因素，以開發(fā)有效的方法來快速鑒定hvKP。

1.2 高毒力莢膜血清型

莢膜多糖既是肺炎克雷伯菌重要的抗原物質(zhì)，也是其主要的毒力因子。根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)及抗原性不同，可將肺炎克雷伯菌分為至少82個莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57攜帶多種毒力基因，與各種侵襲性感染密切相關(guān)，是hvKP常見的高毒力血清型[13]。根據(jù)比較莢膜多糖合成基因的序列差異，以特異性區(qū)域設(shè)計引物靶點，通過PCR擴增技術(shù)確定高毒力血清型，可以初步篩選出hvKP。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是通過PCR擴增多個管家基因的核苷酸序列，結(jié)果以序列分型ST表示，常用于分析肺炎克雷伯菌菌株間的變異及流行特征。

K1、K2血清型是引起肝膿腫的主要高毒力血清型，也是臨床上最常見的hvKP血清型[14]。hvKP不同ST分型與血清型存在較強相關(guān)性，ST23常存在于K1血清型，ST29、ST65、ST86和ST375常存在于K2血清型[15]。

針對K1血清型hvKP，浙江大學(xué)張嶸教授團隊[16]報道了一種可以進行快速鑒定的方法，該方法利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)，通過測試遺傳算法(GA)、支持向量機算法(SVM)、監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(SNN)和快速分類算法(QC)，對K1血清型和非K1血清型菌株進行區(qū)分，其中SVM算法最為可靠，其鑒定準確率超過90.0%。

針對K2血清型hvKP，Bialek-Davenet等[17]設(shè)計了一種多重PCR方法來鑒定其常見的克隆序列，包括ST86、ST380、ST679、ST65和ST375，多重PCR分析將有助于更好地確定新出現(xiàn)的肺炎克雷伯菌毒力克隆的流行病學(xué)。

由于肺炎克雷伯菌碳青霉烯類耐藥株和高毒力株，可能具有交叉?zhèn)鞑バ?，能夠在醫(yī)院和社區(qū)造成嚴重感染。應(yīng)對這個新出現(xiàn)的問題，Yu等[18]設(shè)計了3種多重PCR方法，能夠準確區(qū)分CR-hvKP的ST258、ST11型菌株和hvKP的ST23、ST65、ST375、ST86型菌株，還可檢測K1、K2、K位點47(KL47)和KL64莢膜血清型。該方法可作為CR-hvKP和hvKP分子監(jiān)測的有效工具，以識別和跟蹤這些菌株的傳播，提供及時的感染控制信息。

除PCR方法外，Siu等[19]還研發(fā)一種基于膠體金的新型免疫層析條(immunochromatographic strip，ICS)，含有抗莢膜多糖抗原的多克隆抗體，能夠特異性鑒定K1、K2血清型hvKP。ICS簡單快速，不需要熟練的操作人員或?qū)Ｓ迷O(shè)備，且檢出限達到105CFU，室溫下儲存穩(wěn)定6個月，可作為篩選大量樣本(如流行病學(xué)研究)的快速工具。ICS還能在5 min內(nèi)直接檢測膿液引流樣本或血培養(yǎng)陽性樣本中的K1、K2血清型hvKP，鑒定準確性可與PCR方法相媲美[20]。

2 hvKP的毒力基因鑒定

2.1 毒力基因概況

與hvKP毒力相關(guān)的基因有很多，主要涉及莢膜多糖、菌毛、鐵載體等方面。黏液表型調(diào)節(jié)基因A(regulator of mucoid phenotypegene A，rmpA)/rmpA2和黏液相關(guān)基因A(mucoviscosity-associated gene A，magA)調(diào)控莢膜多糖合成，使hvKP具有抵抗細胞吞噬的能力，是hvKP重要的毒力因子，常作為鑒定hvKP的標志基因。細菌通過菌毛介導(dǎo)與宿主細胞接觸或黏附于黏膜表面，hvKP的黏附相關(guān)因子主要包括I型、III型菌毛，分別由fim、mrk基因調(diào)控。鐵是細菌生長繁殖最基本的營養(yǎng)元素，hvKP只有通過額外分泌鐵載體才能從宿主體內(nèi)獲取鐵，鐵載體主要有腸桿菌素(enterobactin)、耶爾森菌素(yersiniabactin)、沙門菌素(salmochelin)和氣桿菌素(aerobactin)，與此相關(guān)的重要調(diào)控基因包括iroBCDN(沙門菌素生物合成)，iucABCD(氣桿菌素生物合成)和iutA(氣桿菌素轉(zhuǎn)運蛋白)。Russo等[21-22]首次證實在hvKP的4種鐵載體中，氣桿菌素可以明顯提高hvKP在體內(nèi)外模型中的存活率，是介導(dǎo)hvKP毒力的關(guān)鍵因子。氣桿菌素合成蛋白是hvKP最有前途的抗毒靶點，有望開發(fā)出新型hvKP抗菌劑[23]。由于氣桿菌素常表達于hvKP，其相關(guān)生物合成基因簇iucABCD和轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因iutA成為鑒定hvKP的重要指標[24]。

近年來，一些新的hvKP毒力基因不斷被發(fā)現(xiàn)。2017年，Bulger等[25]報道一種新的毒力因子：peg344，它存在于hvKP毒力質(zhì)粒上并廣泛流行，相關(guān)動物實驗顯示，hvKP攻擊肺部后需要peg344才具有完全毒力，而攻擊皮下則不需要，表明peg344是一種內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白。2018年，Palacios等[26]研究發(fā)現(xiàn)兩種新的hvKP毒力調(diào)節(jié)因子：kvrA和kvrB，并證實它們通過調(diào)控hvKP莢膜的表達從而影響菌株毒力。這些研究成果擴展了研究者對hvKP毒力因子的認識，也為鑒定hvKP奠定下基礎(chǔ)。

2.2 多重PCR鑒定毒力基因

與常規(guī)PCR相比，多重PCR在檢測毒力基因和血清型上更有連續(xù)性且快速，使其能夠便捷、有效地對臨床樣本進行實驗室檢測，常在研究中用于鑒定hvKP。雖然hvKP眾多的毒力因子攜帶率均處于高水平，但尚未找到某一個標志物能獨立代表高毒力菌株，故有學(xué)者提出hvKP的生物學(xué)標志可能是幾種毒力因子的組合。

為了探索高診斷性能的基因型或表型生物學(xué)標志，Russo等[27]納入來自北美及英國的hvKP、cKP臨床分離株，使用流行病學(xué)和動物模型對這些分離株的多個關(guān)鍵基因型標記物進行評估。該研究結(jié)果顯示peg344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2在鑒定hvKP方面，診斷準確度大于95%；小鼠膿毒癥模型中，這5種基因與嚴重疾病或死亡的風(fēng)險比均大于25。若將peg344和iucA組合應(yīng)用，則可將鑒定準確性提高至98%。此外，定量鐵載體的產(chǎn)生量≥30 μg/mL也可用于hvKP的預(yù)測，準確度為96%，并顯示出與嚴重疾病或死亡的風(fēng)險比為31.7，表明定量鐵載體溶液測定法具有極佳的鑒定性能，盡管尚無法在實驗室中進行直接測量，但相信將來很有可能得到發(fā)展和應(yīng)用。徐水寶等[28]研究也發(fā)現(xiàn)rmpA2、magA、fimH、aero、iutA、kfuBC可作為hvKP的分子標志物，尤其iutA診斷效能最高。這些數(shù)據(jù)有力地支持了毒力基因用于鑒定hvKP的高準確性，有助于開發(fā)出更多的快速多重PCR檢測手段。

盡管拉絲試驗曾被作為鑒定hvKP的常用方法，但如今的研究多以hvKP的毒力基因作為鑒定分子標志物，或以拉絲試驗與毒力基因組合應(yīng)用，并逐漸被學(xué)術(shù)界所認可。筆者將近年來文獻報道的多重PCR方法鑒定hvKP進行總結(jié)，如表1所示，可以看出，以一種或多種毒力基因組合作為hvKP鑒定方法已成為研究趨勢。

表1 近年來文獻中關(guān)于hvKP的定義標準Tab.1 Standards of hvKP in literatures in recent years

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)鑒定毒力基因

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是在單一恒定溫度下使用4～6個引物，通過鏈置換DNA聚合酶快速擴增獲取新DNA的一種方法。Liao等[41]利用LAMP識別peg344基因靶位，建立了hvKP的快速分子診斷方法。該團隊所設(shè)計的LAMP能在65℃下特異性地將hvKP和cKP區(qū)分開，60 min內(nèi)即可完成檢測，靈敏度是普通PCR方法的100倍，而且檢測到的hvKP毒力表型與小鼠致死率試驗及血清殺傷試驗一樣精確。LAMP擴增過程不需要熱循環(huán)儀，也不需要電泳即可觀察到擴增產(chǎn)物，操作簡便、快速，可用于實驗室常規(guī)鑒別hvKP和cKP。以peg344基因為靶點的LAMP，極有可能將成為欠發(fā)達地區(qū)開展hvKP流行病學(xué)調(diào)查的有力工具。

2.4 MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定毒力基因

MALDI-TOF MS作為一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，具有快速、準確及高通量等強大優(yōu)勢，已成為一項高效的微生物快速鑒定技術(shù)，逐漸應(yīng)用于臨床微生物實驗室。與此同時，該技術(shù)在鑒定hvKP毒力基因方面也引起學(xué)者們的關(guān)注。孫巧玲等[42]研究證實MALDI-TOF MS可以快速區(qū)分攜帶rmpA2毒力基因的hvKP，靈敏度和特異度都在90%以上。值得注意的是，MALDI-TOF MS為快速檢測hvKP毒力基因方面提供了思路，但仍需展開進一步臨床驗證。

2.5 毒力質(zhì)粒鑒定

隨著基因測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，宏基因組測序結(jié)果顯示大部分hvKP都攜帶一個約220kb大小的質(zhì)粒(pLVPK)，或這個質(zhì)粒的一部分(pLVPK-like)。通常pLVPK質(zhì)粒包含4個主要毒力基因(iucA、rmpA、rmpA2、iroN)，若這4個基因全部檢出，說明菌株攜帶完整的pLVPK質(zhì)粒；若只是部分檢出，說明菌株攜帶的pLVPK-like質(zhì)粒。Struve等[43]研究中檢測到的所有hvKP克隆譜系均含有pLVPK質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有高度保守性，編碼氣桿菌素、沙門菌素以及rmpA2，表明毒力質(zhì)粒在hvKP致病中發(fā)揮重要作用。因此，有文獻將pLVPK質(zhì)粒作為鑒定hvKP的生物學(xué)標志[44]。

毒力質(zhì)粒在推動hvKP耐藥性的快速傳播方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Gu等[45]報道了浙江某大型醫(yī)院重癥監(jiān)護病房暴發(fā)由CR-hvKP引起的呼吸機相關(guān)肺炎，測序結(jié)果顯示所有的CR-hvKP均屬同一個ST11型克隆株，這些CR-hvKP出現(xiàn)是因為ST11型CR-KP菌株獲得pLVPK-like毒力質(zhì)粒。毒力質(zhì)粒幾乎都攜帶數(shù)個毒力基因，在鑒定hvKP方面具有獨特優(yōu)勢，但由于需要對菌株進行基因組測序，價格昂貴，難以在普通實驗室廣泛開展，目前多應(yīng)用在科研或疑難菌株鑒定方面。

3 hvKP的毒力評估

3.1 抗中性粒細胞吞噬試驗

中性粒細胞吞噬在機體抗細菌感染的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，莢膜多糖使肺炎克雷伯菌能夠?qū)怪行粤＜毎耐淌勺饔?，并介?dǎo)菌體逃避或抵抗宿主的免疫殺傷。吞噬和胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞的胞內(nèi)和胞外抗菌機制，而hvKP在抵抗中性粒細胞介導(dǎo)的吞噬及細胞內(nèi)殺傷的能力均明顯強于cKP，還能抵抗中性粒細胞產(chǎn)生的NETs捕獲作用[46]。舒玲斌等[47]研究顯示抗中性粒細胞吞噬試驗耗時短，成本低，結(jié)果易于判斷，是判斷hvKP毒力的簡單有效方法。因此，抗中性粒細胞吞噬試驗作為衡量hvKP毒力的重要標準之一，可作為鑒定hvKP的輔助方法。

3.2 動物感染模型

動物感染模型最大的優(yōu)點是可以直觀地表現(xiàn)出細菌毒力的大小，因此被廣泛用于評估病原體的毒力。hvKP因具有獨特的表型以及攜帶多種毒力基因，毒力往往很強，少量細菌即可造成小鼠死亡，半數(shù)致死量(LD50)多在1×103以下。然而，此類動物模型成本昂貴，試驗周期長，且需要使用生物安全2級設(shè)施，所以并不適用于大規(guī)模檢測。大蠟螟是近20年中開發(fā)的高通量動物模型，其幼蟲成本低廉，易于獲得，可以在較寬溫度范圍內(nèi)飼養(yǎng)，是評估肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)因素的有效模型，在菌液接種12h后即可進行毒力的檢測[48]。Shi等[49]研究還證實大蠟螟感染模型的LD50適合驗證hvKP的毒力水平，評價效果準確。因此，大蠟螟感染模型在越來越多的研究中被用于評估hvKP的毒力。

然而，Russo等[50]最新研究發(fā)現(xiàn)遠交小鼠感染模型對于區(qū)分hvKP和cKP非常準確，但在大蠟螟感染模型中觀察到hvKP和cKP毒力的顯著重疊，表明大蠟螟感染模型還不能完全準確區(qū)分hvKP和cKP。為了提高鑒定準確性，Li等[51]采用大蠟螟毒力試驗與拉絲試驗相結(jié)合的方式來鑒別hvKP和cKP，靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均明顯高于僅用大蠟螟毒力試驗獲得的值?？梢钥闯?，采用大蠟螟毒力試驗與拉絲試驗相結(jié)合是一種相對簡便、準確鑒別hvKP和cKP的方法。

4 結(jié)語

目前，hvKP的感染病例早已從最初的亞洲地區(qū)蔓延至全球范圍，針對hvKP的研究也有長足進步，但仍無絕對特異性的鑒定指標，通常還是基于hvKP的獨特表型和基因型這兩個方面做出判斷。傳統(tǒng)拉絲試驗操作簡單，在臨床上初步篩查高毒力菌株還是具有一定的參考意義。從分子生物學(xué)角度檢測hvKP相關(guān)的毒力基因、莢膜血清型、ST分型，亦或是利用動物感染模型驗證高毒力，均可增加hvKP鑒定的準確性。新興的MALDI-TOF MS技術(shù)、宏基因組測序技術(shù)，與傳統(tǒng)的基因分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，有望為臨床提供快速的病原學(xué)證據(jù)，從而及時有效治療hvKP引起的感染。