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        基于中性紅染色的原水藻類細胞快速檢測方法

        2022-10-14 02:15:44黃宗耀
        凈水技術 2022年10期
        關鍵詞:檢測方法

        馬 越,陳 琳,黃宗耀

        (深圳市深水龍華水務有限公司,廣東深圳 518000)

        水庫水季節(jié)性藻類激增是影響水廠水處理工藝的重要因素之一。藻類激增不僅會嚴重影響水質(zhì),更有堵塞砂濾池的風險。研究表明,藻類激增會使水體pH增高、總堿度降低,影響水處理效果[1]。藻細胞的死亡、腐敗會產(chǎn)生藻源性嗅味物質(zhì),常規(guī)水處理工藝很難將其去除,進而引起出廠水的嗅味風險[2]。此外,在針桿藻激增時,倘若不能及時預警并采取相應措施,過多的針桿藻會堵塞砂濾池,嚴重影響生產(chǎn)。為使水廠能夠及時有效預警該情況,對水源水中藻類種屬及數(shù)量進行快速檢測尤為重要。

        隨著技術的發(fā)展,PCR、環(huán)介導等溫擴增、基因芯片、流式細胞術等技術被應用到藻類檢測領域[3-8],但是繁多的檢測方法中仍缺少兼具強普適性、高準確性的適用于水廠化驗室的快速檢測法。目前水廠化驗室對水源水中藻類的檢測方法主要為葉綠素a測定法[9]和顯微鏡計數(shù)法。葉綠素a測定法多用于水廠在線儀表對水源水中藻類數(shù)量的監(jiān)測,由于水源水渾濁度高、雜質(zhì)較多、前處理不充分等,該方法存在檢測結果偏差較大、不能準確反映水源水藻類含量、不能區(qū)分藻類種屬的問題。顯微鏡計數(shù)法是目前水廠化驗室藻類計數(shù)的主要方法,通過顯微鏡與計數(shù)框進行直接定量,前處理為沉淀法和抽濾萃取法[10]:沉淀法通常采用魯哥試劑固定48 h,利用虹吸法去除上清液,將剩余的25 mL藻細胞沉淀液轉移并定容到50 mL,利用顯微鏡進行物種鑒定,定性、定量分析藻類的豐度,該方法耗時較長,前處理和濃縮操作要求較高,需要有經(jīng)驗的化驗員完成;抽濾萃取法為直接使用0.45 μm的濾膜對1 L水樣進行抽濾,濃縮到50 mL后取100 μL溶液鏡檢,該方法耗時較短,但存在部分小且透明的藻細胞不易被觀察到的問題,與國標規(guī)定的魯哥試劑檢測方法存在一定的誤差,多用于應急檢測。

        已有研究表明,中性紅易溶解在脂類物質(zhì)中[11],而微藻細胞表面的質(zhì)膜含有豐富的卵磷脂和膽固醇,因此,中性紅可用于微藻細胞染色。王帥等[12]發(fā)現(xiàn),相較于5-氯甲基熒光素二乙酸酯、熒光素二乙酸酯,中性紅更適合于檢測船舶壓載水中微藻活細胞。王珂等[13]以銅綠微囊藻為材料,發(fā)現(xiàn)中性紅質(zhì)量濃度為2 mg/L染色15 min時,染色率達到98%以上,而常用的臺盼藍染色效率只能達到50%左右。由此可見,中性紅在銅綠微囊藻、船舶壓載水微藻活細胞的檢測中有較好的應用效果,但其在藻類種屬較為復雜的水源水檢測中應用較少。目前,實驗室藻類檢測方法繁多,但是沒能找到一種或幾種適用于水廠化驗室的精確度高、快速的檢測方法。在已有研究基礎上結合實際應用的痛點,本研究圍繞水廠化驗室藻類檢測沉淀法耗時長、抽濾萃取法誤差較大等問題,嘗試將中性紅染色與抽濾萃取法相結合,利用中性紅可積聚在植物細胞質(zhì)或液泡內(nèi)的特性,對深圳某水庫中的藻細胞進行短時染色檢測,結果顯示中性紅能夠快速、高效地使水庫水中常見的3種門23種屬的藻細胞著色。本研究為水廠化驗室提供了普適性強、操作簡便、準確性高的快速藻細胞檢測方法。

        1 試驗材料和方法

        1.1 試驗材料

        本研究選擇的藻種為不分種群的自然群體,取自深圳市某水庫。該水庫水溫均值為23 ℃,渾濁度均值為2.7 NTU,總氮平均質(zhì)量濃度為2.03 mg/L,總磷平均質(zhì)量濃度為0.015 mg/L。原水藻細胞量為2×105~9×106個/L,主要為綠藻、硅藻和藍藻。

        1.2 染色劑的配制

        中性紅[13]:取1 g中性紅粉末溶于100 mL蒸餾水中,30~40 ℃加熱,待中性紅溶解后,用濾膜過濾,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的中性紅儲存液,裝入棕色瓶中置于4 ℃保存。使用時用蒸餾水將中性紅溶液稀釋至所需濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        魯哥試劑[14]:將20 g碘化鉀溶于200 mL 冰醋酸(10%)溶液中,溶解后再加10 g碘,全部溶解后配制成碘質(zhì)量濃度為50 mg/mL的魯哥氏碘液,貯存于密閉的棕色試劑瓶中,避光保存。

        1.3 細胞染色與鏡檢

        中性紅:分別在1 L水樣中加入1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 mL的中性紅儲存液,混合均勻,分別染色10、20、30、40 min,用0.45 μm的濾膜抽濾,隨后用25 mL蒸餾水洗脫,定容至50 mL后,取100 μL在顯微鏡(奧林巴斯BX51)下檢測,用拍攝系統(tǒng)(CMOS相機、萬深AlgaeC浮游生物鑒定計數(shù)軟件)記錄染色情況,并計數(shù)拍攝染色情況。所有試驗均重復3次。

        魯哥試劑:在1 L水樣中加入10 mL的魯哥氏碘液,混合均勻后自然沉降48 h,利用虹吸方法去除上清液,將剩余的25 mL藻細胞沉淀液轉移并定容到50 mL,取100 μL,在同樣條件下拍攝染色情況,并計數(shù)拍攝染色情況。所有試驗均重復3次。

        染色后采用100 μL浮游植物計數(shù)框鏡檢藻細胞。

        染色率(r)計算如式(1):藻細胞被中性紅染成紅色,每個視野里分別計算著色細胞和未著色細胞。

        r=B/(A+B)×100%

        (1)

        其中:r——染色率;

        A——視野中未著色細胞數(shù),個;

        B——視野中著色細胞數(shù),個。

        1.4 統(tǒng)計分析

        試驗數(shù)據(jù)采用相對標準偏差(RSD)分析組內(nèi)檢測結果的精密度,計算如式(2)。

        RSD=(SD/X)×100%

        (2)

        其中:SD——標準偏差;

        X——算數(shù)平均值。

        組間分析:(1)采用中性紅檢測均值相對于傳統(tǒng)魯哥試劑檢測均值的偏差來表示準確性;(2)采用組間單因素方差分析進行中性紅檢測均值相對于傳統(tǒng)魯哥試劑檢測均值的差異性分析。

        2 結果和討論

        2.1 中性紅染藻細胞的濃度和時間

        染色劑濃度對細胞染色存在較大影響,通常低濃度染色效果不好,濃度過高可能影響細胞活性。為探究中性紅染色的最適質(zhì)量濃度,本研究將10 mg/mL中性紅儲存液稀釋為10.0、5.0、3.3、2.5、2.0 mg/L進行試驗。結果顯示,10.0 mg/L時染色過深,不適合鏡檢計數(shù),2.0 mg/L染色效果較差,染色率<30%,故而排除這兩種染色濃度。如圖1所示,隨著中性紅濃度的升高,染色率逐漸增高,質(zhì)量濃度增大至5.0 mg/L時染色率雖有明顯提高,但是藻細胞出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象,影響觀察和計數(shù);質(zhì)量濃度達到3.3 mg/L時,染色率大于75%,明顯優(yōu)于魯哥試劑經(jīng)48 h固定的染色率。結果表明,使用3.3 mg/L中性紅對水源水中藻細胞進行染色時效果最佳。

        圖1 魯哥試劑和不同濃度中性紅對染色效果的影響

        確定針對水源水染色時中性紅的最佳使用濃度后,本研究繼續(xù)使用3.3、2.5 mg/L中性紅對水源水中藻細胞分別染色10、20、30、40 min,重復染色3次,計算染色率。如圖2所示,在10~30 min,隨著染色時間的增長,染色率增加;30 min后染色率開始下降。該試驗結果表明,3.3 mg/L中性紅染色30 min鏡檢效果最佳,染色率大于80%。

        圖2 染色時間對染色效果的影響

        2.2 基于中性紅快速檢測的準確性分析

        中性紅可將藻類檢測時間縮短到30 min,相對于常規(guī)魯哥試劑48 h檢測有較大的提升,接下來,本研究連續(xù)5周使用中性紅(3.3 mg/L染色30 min)和經(jīng)典方法魯哥試劑[15](固定染色48 h)檢測深圳某水庫藻細胞數(shù)量。結果如表1所示,中性紅快速染色檢測法的檢測結果與常規(guī)魯哥試劑檢測方法的結果偏差在-7.74%~3.12%,小于±10%。對兩種檢測方法進行組間單因素方差分析,P值為0.970 6。以上結果表明中性紅檢測法可作為替代常規(guī)魯哥試劑的快速染色檢測法,具有較好的準確性和穩(wěn)定性。

        表1 基于中性紅快速檢測的準確性分析

        2.3 中性紅快速檢測法在深圳某水庫水藻類檢測中的應用

        藻類是含有光和色素的低等植物,多數(shù)個體微小,需借助顯微鏡檢測。部分藻細胞含有大而明顯的液泡,例如硅藻門中的直鏈藻、針桿藻、菱形藻,該類藻細胞便于鏡檢觀察;部分藻細胞小且透明,不便于鏡檢觀察,例如綠藻門的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻等。已有研究表明,中性紅可以通過細胞攝取進入細胞并滯留在溶酶體內(nèi)[16]。在活細胞中,中性紅可將液泡染為紅色;當細胞死亡后,中性紅會充滿整個細胞[17]。

        鑒于此,本研究將中性紅與抽濾萃取法相結合,以水源水中藻細胞為檢測對象,探究了染料的最佳使用濃度和染色時間,并將該檢測方法應用于深圳某水庫水藻細胞的檢測中。取1 L水庫水于燒杯中,使用質(zhì)量濃度為3.3 mg/L的中性紅染色30 min,抽濾后鏡檢,結果如圖3所示,中性紅能夠快速、高效地使水庫水中常見的3個門的藻細胞著色。該方法不僅能將藻細胞的液泡染為紅色(圖3中的綠藻門小球藻屬、柵藻屬、盤星藻屬、卵囊藻屬;藍藻門橋彎藻屬、微囊藻屬等),而且能夠使藻細胞的輪廓呈現(xiàn)出清晰的紅色,便于鏡檢分析,較好地解決了小且透明的藻細胞的檢測難題。使用該方法對深圳某水庫水藻類進行連續(xù)6個月的檢測,結果如表2所示,該水庫水藻類主要包含5個門28個屬,其中,最常見的為硅藻門、綠藻門、藍藻門中的26個種屬,該水庫水大于85%的常見藻類(24個屬)能夠被中性紅染色。綜上,中性紅快速檢測法能夠較好地解決小且透明的藻細胞的鏡檢難題,對于水庫水中的主要藻類有較好的染色效果。

        圖3 中性紅快速檢測法的顯微鏡檢測結果

        表2 深圳某水庫主要藻類和中性紅染色

        3 結論

        (1)本文將中性紅與抽濾萃取法相結合,搭建基于中性紅染色的水源水藻細胞快速檢測方法。中性紅染色效果明顯,染色最佳質(zhì)量濃度為3.3 mg/L,染色時間為30 min,檢測結果與常規(guī)魯哥試劑檢測結果相一致(偏差小于±10%)。該方法既能確保準確性,又能將檢測時間從48 h縮短到30 min。

        (2)基于中性紅染色的水源水藻細胞快速檢測方法能夠快速、高效地使水庫水中常見的3個門24個屬的藻細胞著色。該方法不僅能將藻細胞的液泡染為紅色,而且能使藻細胞的輪廓被標記為紅色,便于鏡檢分析,有效地解決了小且透明的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻、菱形藻、橋彎藻、微囊藻的檢測難題,為提高水廠化驗室藻類檢測效率和應對原水水質(zhì)突變能力提供了有力的支持。

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