劉 稜，方逸川，孫孝龍

(西南林業(yè)大學濕地學院，國家高原濕地研究中心，云南昆明 650224)

天然有機質(zhì)(NOM)是廣泛存在于自然界中的一種混合物，主要由動植物殘體的分解、降解等作用形成。普遍認為NOM是具有羧基、酚基、芳香基、酚羥基、脂肪鏈和苯環(huán)等活性官能團的混合物[1]。NOM分為腐殖質(zhì)和非腐殖質(zhì)兩類：腐殖質(zhì)分為富里酸、胡敏素和胡敏酸；而非腐殖質(zhì)則包括糖類、纖維素、蛋白質(zhì)等[1]。在水體和土壤中成分以腐殖質(zhì)為主，占據(jù)該兩種生態(tài)系統(tǒng)中總有機質(zhì)的50%～80%[2]。腐殖質(zhì)具有如酚基、氨基、羧基和硫醇基等官能團，可與金屬離子、離子性、極性有機化合物發(fā)生作用，改變形態(tài)和分布情況，參與營養(yǎng)元素循環(huán)[3]。NOM的結(jié)構、來源和化學組成十分復雜，所以常常通過研究含有羧基、苯酚、烯醇、醇、羰基、氨和硫醇等氮氧硫官能團的芳香族和脂肪族有機化合物的異質(zhì)混合物溶解性有機物(DOM)來表征NOM的性質(zhì)。在環(huán)境中扮演著不可或缺角色的DOM，該物質(zhì)的復雜組成成分、化學結(jié)構、不同來源和濃度差異等性質(zhì)特征的變化都會對生態(tài)系統(tǒng)和該物質(zhì)的去除效率造成影響，并對過程中可能會產(chǎn)生致癌副產(chǎn)物的多種處理工藝等方面息息相關，是毒理學、生態(tài)學、環(huán)境質(zhì)量標準、污染控制與治理工程等研究十分關注的問題，因此，對有機質(zhì)相關的研究是目前科研工作中的一大熱點[4-5]。

三維激發(fā)-發(fā)射矩陣(EEM)是一種操作簡單、消耗量小、成本低廉、分析迅速、靈敏度高的技術，但是單獨使用EEM，則會出現(xiàn)熒光峰疊加、同類熒光峰的位置不同、無法識別等局限問題。Stedmon等[6]最早提出可有效識別EEM中信息成分并追蹤它在環(huán)境中行為的平行因子分析方法(PARAFAC)，如式(1)。

(1)

其中：F——熒光因子數(shù)；

xijk——第i個樣品在發(fā)射波長(Em)j和激發(fā)波長(Ex)k處的熒光強度；

εijk——模型殘差；

aif——負載矩陣A中的元素；

bjf——負載矩陣B中的元素；

ckf——負載矩陣C中的元素。

aif與樣品i中fth分析物的濃度(例如摩爾)成正比。bjf與fth分析物在發(fā)射波長j處的熒光量子效率(作為熒光發(fā)射的吸收能量的分數(shù))線性相關。因此，具有典型元素bjf的矩陣是fth分析物的發(fā)射光譜的估計，直至達到標度。同樣，ckf與在激發(fā)波長k下的比吸收系數(shù)(例如摩爾吸收率)線性成比例。F定義了模型中組件的數(shù)量，殘差矩陣εijk代表了模型未考慮的可變性。通過最小化殘差平方和的過程找到模型[6]。該模型是通過交替最小二乘算法最小化殘差平方和來計算的。

多項研究表明，該方法可以去除散射峰所影響的光譜區(qū)域，如將瑞利峰以下的EEMs區(qū)域設為0，通過從樣品光譜中減去Milli-Q水光譜來去除拉曼效應區(qū)域。對高殘差值和杠桿值的樣本采用非負性約束，將高殘差值和杠桿值剔除為離群值，再進一步分析前應通過離群值函數(shù)去除[7]。通過殘差分析、半剖分分析、隨機初始化和目視檢測各組分的光譜形狀，驗證最優(yōu)熒光DOM組分的數(shù)量[4]。現(xiàn)可使用Matlab上的DOM Fluor工具箱、efc平臺等可進行PARAFAC[6-7]。

三維熒光光譜-平行因子分析(EEM-PARAFAC)集成了EEM經(jīng)濟、高效、選擇性好、靈敏度高且不破壞樣品結(jié)構等諸多優(yōu)點。該方法不僅解決了單獨使用EEM出現(xiàn)的弊端，同樣還擁有了PARAFAC化繁為簡的特點，將大量的樣本數(shù)分解成單個的熒光成分，從而確定獨立熒光成分的強度和位置，還可用因子得分比值替代EEM中峰強度比值對水體進行空間區(qū)域的特征分析[8]。因此，EEM-PARAFAC擁有更系統(tǒng)和全面解釋數(shù)據(jù)和分析數(shù)據(jù)的特有優(yōu)勢，易于分析DOM的結(jié)構組成等，有著非常廣闊的應用前景。本文通過歸納和總結(jié)EEM-PARAFAC表征DOM的來源、結(jié)構、降解和吸附絡合的相關研究，為未來該研究的進一步發(fā)展提供數(shù)據(jù)參考。

1 有機質(zhì)來源

通過分析、研究和表征環(huán)境污染的源頭、源強及類別，為有效全面地了解和深入研究污染的環(huán)境行為特性、生態(tài)系統(tǒng)的維持穩(wěn)定及影響、污染的控制修復治理提供基礎理論依據(jù)。

利用EEM-PARAFAC方法，發(fā)現(xiàn)不同土地利用類型、地區(qū)、時期、用途來源的DOM等，都會導致其中的結(jié)構和性質(zhì)的不同。例如，兩種不同土地類型來源的有機質(zhì)差異較大，森林和濕地沉積物相比較之下，森林土壤中DOM的芳香性、疏水性分數(shù)和分子大小更高，原生源沉積物比具有陸地腐殖質(zhì)樣物質(zhì)的土壤中類蛋白組分更高(與低聚縮芳烴結(jié)構和高含氧官能團有關)[5]；例如，不同植物來源的藻類為主的沉積物和大型植物為主的沉積物，藻類為主的沉積物中DOM類蛋白質(zhì)物質(zhì)多于大型植物為主的沉積物中的DOM(C峰強度較低的藻類衍生DOM具有高蛋白低腐殖質(zhì)的特征)[9]；例如，不同產(chǎn)生來源的DOM，水中陸生源DOM含有的芳環(huán)結(jié)構多于自生源DOM，其腐殖化程度、芳香性、疏水性高[10]；例如，不同地區(qū)的土壤，黑龍江黑土、四川紫土和浙江紅土的DOM腐殖質(zhì)樣物質(zhì)較多，貴州黃土和廣東、廣西紅土的芳香度較低，微生物源蛋白樣成分C3比例較高[4]；例如，不同時段的來源，冬季DOM中的類色氨酸主要來源陸地和長江口，夏季海水輸入增多，光化學降解增多，微生物利用活性有機物增加，類腐殖質(zhì)C4(峰值M)發(fā)生明顯變化等[11]，不同的來源導致DOM的分子結(jié)構千差萬別。EEM-PARAFAC方法涉及熒光EEMS采集、數(shù)據(jù)處理和PARAFAC擬合兩種算法，兩種算法都是根據(jù)熒光組分(熒光團)的相對組成生成指紋[12]。通過繪制得分矩陣，將成分得分相似的水樣分組，可對不同來源水樣進行客觀分類。該方法相比較現(xiàn)在大量使用的穩(wěn)定同位素分析方法而言，雖無法溯源至具體某一種物質(zhì)，但EEM-PARAFAC分析方法不必對各污染源與污染地點的物質(zhì)進行比對、追蹤和分析校對，就可將污染物的來源方向判定清楚，之后通過有針對性地使用同位素等其他方法進行定向追蹤，可大大節(jié)省了時間和精力成本。表1為EEM-PARAFAC分析DOM后得到幾種來源的組分情況。

表1 熒光光譜參數(shù)描述

未來通過對不同來源數(shù)據(jù)(土壤、河流、廢水、生物糞便、雨水等)的不斷補充，EEM-PARAFAC方法已被廣泛應用于土壤和水體的研究中，且因其易于實時監(jiān)測，未來將逐漸成為各方面辨別污染物來源的便捷方法之一，通過查詢數(shù)據(jù)庫得知有機質(zhì)的主要來源和未來應重點關注區(qū)域內(nèi)的治理方向。

2 DOM分子結(jié)構

熒光強度和熒光峰都與結(jié)構之間關系密切，而熒光峰、熒光強度又與性質(zhì)和活性官能團密切相關，所以結(jié)構的研究有利于進一步了解和分析DOM在整個環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化及作用機理和規(guī)律，進而研究多種物質(zhì)與DOM相互作用，深入了解DOM在環(huán)境中的變化行為，為今后的相關環(huán)境研究和修復提供科學依據(jù)。

利用EEM-PARAFAC對DOM分子結(jié)構的研究已被廣泛使用，因EEM-PARAFAC不僅可分離出熒光峰的種類，同時還可確定熒光峰的強弱，跟蹤芳香族胡敏酸分子的分子大小變化，從而對DOM進行定性和定量的分析。通過EEM-PARAFAC技術，DOM在結(jié)構上的部分相關研究如表2所示。

隨著環(huán)境、來源等外界條件的改變和影響，DOM各組分中的結(jié)構與成分都會發(fā)生一定的改變，從而致使DOM顯現(xiàn)出不同的性質(zhì)。例如，腐殖質(zhì)分子在堿性溶液中呈現(xiàn)出線性結(jié)構，暴露出許多別的試驗中未檢測到的熒光基團[23]；城市區(qū)域DOM以類腐殖質(zhì)物質(zhì)為主，占比達到61.3%，而城鄉(xiāng)結(jié)合區(qū)域由于受到更多的生活污水排放的影響，類蛋白質(zhì)物質(zhì)的比例最高，為59.4%(羧基官能團、芳環(huán)氨基酸和芳香結(jié)構的占比差異，芳香結(jié)構在某種程度上可打破π*→π轉(zhuǎn)變等)[24]。這一系列的影響改變了分子結(jié)構，而分子結(jié)構的不同又會造成波長的藍移和紅移、熒光強度的強弱變化的不同以及熒光峰的不同等。反之，也可通過熒光峰的不同、熒光強度的不同、波長位移的變化，推理出分子結(jié)構的變化。

“素養(yǎng)”一詞的含義比“知識”和“技能”更加寬廣?！爸R”與“技能”主要涉及具體學科領域的知識和基本技能，而素養(yǎng)是一個復雜的結(jié)構，其所涉及的內(nèi)涵并非單一維度，而是多元維度的。核心素養(yǎng)不僅僅是知識技能，更重要的是正確的價值觀念、必備的品格和關鍵能力。

通過觀察光譜中各組分的波長，會發(fā)現(xiàn)光譜中常常出現(xiàn)從較長的波長區(qū)域逐漸移到較短的波長區(qū)域(藍移)，從較短的波長區(qū)域逐漸移到較長的波長區(qū)域的現(xiàn)象為紅移現(xiàn)象，對此類現(xiàn)象的解釋有：發(fā)射波長發(fā)生紅移，表明分子量和共軛部分增加，但具有脂肪族部分的π-π系統(tǒng)較少或共軛系統(tǒng)較少[25]；色氨酸殘基被蛋白質(zhì)包裹時，發(fā)射光譜可能發(fā)生藍移[25-26]；微生物熒光峰發(fā)生藍移，是因為一些芳香環(huán)被酸和堿分解、轉(zhuǎn)化為更小的片段[23]。前人早已經(jīng)歸納得出藍移和紅移是因為羧基、羰基、氨基、烷氧基等官能團含量的增多或減少。藍移和稠環(huán)芳烴的分解、減少和大轉(zhuǎn)小分子的結(jié)構相關(線性結(jié)構變成非線性結(jié)構、熒光波長變短、π電子系統(tǒng)的減少、羰基、羥基和氨基等官能團的消失、鏈狀結(jié)構及芳香環(huán)上共軛基團的減少等)；而紅移則是與分子量[4]、芳香性[27]、共軛部分[25]和特定熒光基團(羰基、羧基、羥基和氨基等)等部分的增加相關。

對于熒光強度，以羥基、甲氧基、氨基等低芳香性和剛性、共平面性結(jié)構為主的相對分子質(zhì)量小的DOM產(chǎn)生的熒光強度較強，反之，分子結(jié)構以羧基、羰基等吸電子基團為主的相對分子質(zhì)量大的DOM產(chǎn)生的熒光強度較弱。而對于熒光峰，部分研究表明Em<380 nm的熒光峰是基于含苯環(huán)的熒光團(如羥基和氨基)，Em>380 nm的熒光峰則是基于多環(huán)芳族的結(jié)構[26]。此外，也有研究表明不同波長的熒光峰與DOM中各組成分有關，例如較短的激發(fā)和發(fā)射波長熒光峰與簡單的芳香蛋白質(zhì)類物質(zhì)有關(酪氨酸)，較長激發(fā)波長和短發(fā)射波長熒光峰與溶解性微生物代謝產(chǎn)物有關(類酪氨酸、類色氨酸、類蛋白質(zhì)等)，長激發(fā)和發(fā)射波長熒光峰與類腐植酸有關，短激發(fā)波長和長發(fā)射波長熒光峰與類富里酸物質(zhì)有關等[27-29]。

分子結(jié)構是導致DOM各種反應的關鍵因素，通過針對DOM的分子結(jié)構特質(zhì)，可將物質(zhì)表面的峰值及熒光強度等參數(shù)變化、本身所具有的特征與內(nèi)在結(jié)構變化相結(jié)合，從而進一步深入挖掘DOM分子結(jié)構與其他功能特征變化之間所存在的相關性及差異性[27-29]。

3 DOM降解

DOM的降解對環(huán)境中諸多污染物的降解具有一定的影響作用，也是NOM生物地球化學循環(huán)研究的關鍵，探究DOM降解機理和影響因素，對人類生存發(fā)展和環(huán)境保護以及為建立合理的生態(tài)風險評價和相關污染物的防控措施具有重要意義。光降解和生物降解舉例如表3所示。

表3 EEM-PARAFAC在DOM降解研究的應用

自然界中，DOM的降解主要可分為生物降解和光降解兩種降解方式。二者都是對DOM進行降解，但相較而言，光降解DOM的降解速度和芳香度的還原速度都強于生物降解[36]。

DOM的生物降解，是指微生物對DOM的利用，維持其生命活動。生物降解與光降解最大的區(qū)別在于，生物降解主要降解DOM中的類蛋白組分，例如通過EEM-PARAFAC的熒光成分可知對生物降解的抗性為腐植酸樣組>酪氨酸樣組>色氨酸樣組[37]；生物降解焦化廢水DOM中的類蛋白質(zhì)物質(zhì)會高于類腐殖質(zhì)，因為類蛋白由氨基蛋白酶和多肽等較為簡單分子結(jié)構、分子縮合度較低的有機物質(zhì)組成，易于降解[38]。單一討論生物降解DOM中的蛋白質(zhì)，仍然會出現(xiàn)多種情況，例如生物降解率都隨陸地衍生芳香族化合物比例的增加而降低[39]；親水性類蛋白比疏水性類蛋白更易于被微生物降解；銅綠微囊藻和背星囊藻相比較卵形隱藻釋放的類蛋白，前者更易降解[40]，這都與不同來源的DOM內(nèi)在結(jié)構相關。總之，生物降解DOM多數(shù)會讓其腐殖化程度增加、芳香性減小、不飽和度降低、氧化程度增加、極性增加等。

結(jié)果顯而易見，降解DOM的整個過程都受到了各種各樣因素的影響，但各種因素最終是通過改變DOM的分子結(jié)構和官能團，從而影響DOM的降解效果。通過EEM-PARAFAC的各組分熒光強度和組分變化情況，就可準確得出其中哪部分物質(zhì)發(fā)生變化，但該分析方法并不能對分子結(jié)構的具體變化進行詳細描述和呈現(xiàn)，這時就需要結(jié)合紅外光譜等方法進一步分析。

4 吸附絡合

DOM參與了各種關鍵的環(huán)境和生態(tài)過程，特別是在重金屬(HMs)和持久性有機污染物的生物地球化學循環(huán)和運輸過程中。在有機污染物、HMs等物質(zhì)和DOM的作用中，其作用力多種多樣，例如范德華引力、靜電吸引、π-π共軛效應、疏水性作用、電子給體/電子受體和陽離子橋等[46]，但EEM-PARAFAC方法，能較為準確地評估和分析它們之間的反應，EEM-PARAFAC方法已成為探索機制的重要工具，它們不僅可以減少重疊峰的干擾，還可以提供抗生素、HMs等物質(zhì)遷移、對生物的毒性、生物利用度等定性、定量和特異性的相關指標[47]。這里主要介紹抗生素、HMs與DOM之間的吸附絡合反應。

DOM與抗生素的吸附反應受多方面的影響，但不同的抗生素與DOM作用的組分不同，例如羅克沙胂(ROX)、磺胺喹諾啉鈉(SQ-Na)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)和紅霉素(ERY)等都對DOM中的酪氨酸類和色氨酸類的成分(類蛋白組分)有顯著的猝滅反應，其中SMZ優(yōu)先與DOM中類酪氨酸成分作用，之后是類色氨酸[48]。主要與類腐植酸組分有較為明顯的猝滅反應有雙酚A、卡馬西平等，布洛芬等則主要同類富里酸有猝滅反應[46]。DOM中的O-H、C-H、C-O、N-H、酰胺I和酰胺II，以及芳香族化合物和脂肪族化合物都可與TC反應，蛋白質(zhì)樣熒光團的活性位點酰胺和脂肪族主要與DOM絡合的官能團，因此，類蛋白質(zhì)與TC絡合產(chǎn)生的猝滅效應最為明顯[9]。傳統(tǒng)的類腐殖質(zhì)相比較類色氨酸組分，磺胺甲惡唑(SMX)主要與類腐殖質(zhì)反應，腐植酸的-COOH基團能吸附SMX的-NH2并與之反應，Li等[49]猜測是因為SMX的外層是吸電子基團的磺酰胺苯環(huán)，這導致苯中不存在電子態(tài)，使其成為π電子受體。類似地，胡敏酸的-OH、-O和-NH2是給電子基團，苯骨架富含電子，并且也是π-π電子給體，因此，SMZ可以被π-π電子供體和受體兩者吸附，SMX的N-H易于在胡敏酸表面共享來自H+的電子，并形成弱氫鍵；SMX的結(jié)構中有兩個S=O帶，它們是電子不足的，容易與胡敏酸的-COOH和-OH形成氫鍵。

但眾多研究已然表明，大多數(shù)的抗生素對含有苯環(huán)和給電子基團的類蛋白質(zhì)物質(zhì)(Em<380 nm的熒光峰)的猝滅效應(NOM的微環(huán)境和構象的變化)高于含有多環(huán)芳烴結(jié)構的腐殖質(zhì)物質(zhì)(Em>380 nm的熒光峰)[9]。不同種類的抗生素與DOM的反應不同，舉例如表4所示。

表4 EEM-PARAFAC在DOM與抗生素反應的研究應用

DOM與金屬的絡合反應，同樣受多方面因素的影響，例如含有許多與金屬結(jié)合的酚類、羥基和羧基官能團的天然非晶態(tài)交聯(lián)芳香三維聚合物木質(zhì)素所衍生的腐植酸能與金屬離子發(fā)生較好的絡合反應。但酚類(-OH)、氨基、羧基、羥基和羰基等官能團(配位體)及含量在其中發(fā)揮十分重要的作用。例如銅與DOM的反應，與分布于低分子量DOM中類腐殖質(zhì)和類富里酸的結(jié)合親和力高于分布于高分子量DOM中類蛋白的反應，其原因歸功于芳香族酸性官能團(酚羥基、酚類位點)的存在，而銅與其中的腐殖質(zhì)反應，腐殖質(zhì)中高分子量組分因具有較高芳香性，擁有更多的結(jié)合電位，因而結(jié)合親和性高于低分子量的芳香性組分[52-53]；鉛和Ca(Ⅱ)與類腐植酸的親和力高于類富里酸，其中Ca(Ⅱ)主要與其中的羧基類官能團結(jié)合；Cd(Ⅱ)與類富里酸組分的絡合能力強于類蛋白組分，也強于腐植酸組分的絡合能力，其歸因于Cd(Ⅱ)主要與DOM中的羧基發(fā)生絡合作用，在類富里酸組分中有大量羧基官能團、少量酚羥基官能團，而類蛋白組分中則含有大量酚羥基官能團、少量的羧基官能團[19]；Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)主要與類腐殖質(zhì)和類富里酸組分芳香族和羧基類結(jié)合，也可選擇性芳香類、類羧基類和酚類結(jié)合[54]，其中Fe(Ⅲ)先與胡敏酸中的腐殖質(zhì)組分絡合，F(xiàn)e(Ⅲ)與酯鍵合、醌型環(huán)、芳族基團、脂肪族基團和酚基反應[55]。一般情況下，金屬與DOM中的強點位酚羥基、含氮和含硫基團結(jié)合能力更強，因而大多數(shù)的金屬與類蛋白組分(含氮組分)的絡合能力更強[56]。

DOM的吸附絡合反應中，分子結(jié)構和官能團在其中扮演著重要的角色。在不同的環(huán)境條件下(pH、金屬濃度、來源、分子量、金屬種類等)都是通過改變金屬和DOM分子結(jié)構(官能團)的相關屬性來達到改變二者的相互作用，舉例如表5所示。

表5 EEM-PARAFAC在DOM與金屬反應的相關應用

5 結(jié)論

EEM技術結(jié)合PARAFAC方法能對NOM進行定性和定量的分析。本文簡述了EEM-PARAFAC在有機質(zhì)4個方面：來源、分子結(jié)構、降解機理和吸附絡合的研究，發(fā)現(xiàn)分子結(jié)構可揭示和指引研究NOM與污染物相互作用的機理和研究方向發(fā)展。未來可通過EEM-PARAFAC對分子結(jié)構的進一步研究，將復雜多樣化的問題簡單化和系統(tǒng)化，將大大促進污染物與有機質(zhì)反應的相關研究進展。本文對EEM-PARAFAC在有機質(zhì)相關方面的研究內(nèi)容結(jié)合分子結(jié)構，進行了部分歸納和總結(jié)，為今后NOM三維熒光光譜指紋數(shù)據(jù)庫的建立、NOM組分熒光特性指標標準的統(tǒng)一、污染物的快速識別分析和研究去除提供一定的幫助。