林雨康 易書(shū)林 楊梅林 李幸展 李璟弘 陳濤 談博 張佳敏

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006

腹瀉型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea，IBS-D）是一種常見(jiàn)的功能性腸道疾病，以腹痛、腹部不適為主癥，伴隨排便習(xí)慣和/或性狀的改變［1］。根據(jù)調(diào)查當(dāng)前國(guó)人腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）患病率為1.4%～2.3%［2］。IBS共有4種亞型，而IBS-D 是國(guó)內(nèi)最常見(jiàn)的分型［1］。雖然IBS-D 并非致命性疾病，但其難根治、易復(fù)發(fā)的特征嚴(yán)重影響著患者的日常生活，尤其是睡眠質(zhì)量、心理狀態(tài)和社交活動(dòng)等方面，大大降低了患者生活質(zhì)量和學(xué)習(xí)工作能力。目前中醫(yī)治療IBS-D效果尚可，因此深入探索中藥藥物對(duì)治療IBS-D 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有著巨大前景［3］。本研究通過(guò)建立IBS-D動(dòng)物模型，應(yīng)用葛根素進(jìn)行治療，以內(nèi)臟敏感性及腸組織的神經(jīng)遞質(zhì)水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討葛根素對(duì)IBS-D 腸道平滑肌神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)的影響，有望為IBS-D 的中藥治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用基礎(chǔ)。

材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF 級(jí)4 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為（100±10）g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0034，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證［SCXK（粵）2018-0085］。

本研究通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（202103160003）。

于2021 年11 月開(kāi)始，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，正常進(jìn)食和飲水，晝夜光照恒定，各循環(huán)12 h。環(huán)境溫度保持于22～25 ℃，濕度為45%～55%，大鼠分4 籠飼養(yǎng)，每籠6 只，每天及時(shí)給水及添加滅菌全價(jià)顆粒飼料，及時(shí)清理排泄物及每日更換鼠籠，并且對(duì)鼠籠進(jìn)行消毒處理。

2、主要藥物與試劑

葛根素（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-22-10407）；乙酰膽堿（Ach）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A105-1）；一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A102-1）；大鼠五羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)TAE-106r）。

3、主要儀器

BioSpec-nano 島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；勻漿機(jī)（北京天根生化科技有限公司）；各種量程可調(diào)型移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；HR/T16M 高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；醫(yī)用彈力網(wǎng)狀繃帶（天津市華澳醫(yī)療保健有限公司）；臺(tái)式水銀血壓計(jì)（上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；8Fr導(dǎo)尿管（重慶加加林世紀(jì)醫(yī)療器械有限公司）。

4、實(shí)驗(yàn)方法

4.1、IBS-D 大鼠模型的建立及評(píng)價(jià) 根據(jù)文獻(xiàn)建立IBS-D 大鼠模型［4］。造模方法為每日給予 2 h 束縛刺激，連續(xù)14 d。具體刺激方法為：乙醚輕度麻醉后，用醫(yī)用彈性網(wǎng)狀繃帶束縛大鼠的前上肢、前肩、胸部，限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其他活動(dòng)。造模完成后統(tǒng)計(jì)模型組大鼠內(nèi)臟敏感性、排便面積指標(biāo)，并觀察模型組病理學(xué)有無(wú)器質(zhì)性改變，以確定IBS-D 模型復(fù)制是否成功。若模型組與對(duì)照組大鼠對(duì)比出現(xiàn)內(nèi)臟敏感性升高、排便面積增加的癥狀并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且模型組病理學(xué)無(wú)器質(zhì)性改變，說(shuō)明IBS-D模型成功復(fù)制。

4.2、動(dòng)物分組及給藥 24 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組6 只、造模組18 只。造模組在造模成功后分為模型組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組，每組6 只。在造模完成后連續(xù)14 d 給予灌胃給藥，藥物劑量依據(jù)2020 版《中國(guó)藥典》［5］規(guī)定葛根臨床用量為9～15 g，葛根素的得率為1.2%，按成人70 kg、葛根10 g 用量算，則人用葛根為142.86 mg/kg，換算后大鼠葛根劑量為0.9 g/kg，換算為葛根素為11 mg/kg。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)設(shè)葛根素低、高劑量組的大鼠給藥量分別為22、44 mg/（kg·d），每日灌胃前精確稱量4.4 g 葛根素，取少量純水充分溶解后轉(zhuǎn)入250 ml 容量瓶中定容，混勻后使用，低劑量組將溶液用純水稀釋1 倍后使用，每日灌胃前稱量大鼠質(zhì)量，計(jì)算出所需灌胃劑量。同時(shí)對(duì)照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。

4.3、大鼠結(jié)腸組織病理改變?cè)u(píng)估 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理改變，沿結(jié)腸肌肉方向取大鼠結(jié)腸組織標(biāo)本，厚度0.2～0.3 cm，盡量剔除結(jié)腸組織上附著的脂肪組織，生理鹽水沖洗后，使用甲醛固定脫水、浸入石蠟包埋、切片后使用HE 染色法進(jìn)行染色、封片，進(jìn)行病理學(xué)分析。觀察是否存在潰瘍或炎癥性病理改變。

4.4、大鼠內(nèi)臟敏感性評(píng)估 采用球囊結(jié)直腸擴(kuò)張（CRD）方法，在第28 天時(shí)檢測(cè)其內(nèi)臟敏感性。操作步驟如下：實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h，將導(dǎo)尿管和球囊通過(guò)肛門(mén)插入大鼠結(jié)直腸后用膠帶固定，肛門(mén)外側(cè)端球囊固定在距肛門(mén)1 cm 的尾部，將血壓計(jì)通過(guò)三通閥與之連通，限制大鼠運(yùn)動(dòng)。逐步增大壓力并仔細(xì)觀察大鼠反應(yīng)，記錄大鼠在結(jié)直腸內(nèi)壓力達(dá)到60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）時(shí)的活動(dòng)并進(jìn)行腹壁回縮反射（AWR）評(píng)分［6］。具體標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠對(duì)CRD無(wú)行為反應(yīng)計(jì)0 分；大鼠頭部有短暫活動(dòng)但身體無(wú)反應(yīng)計(jì)1 分；大鼠腹壁肌肉出現(xiàn)收縮計(jì)2 分；大鼠腹部肌肉收縮并能離開(kāi)桌面計(jì)3 分；大鼠身體呈弓形并伴有骨盆抬起計(jì)4分。

4.5、大鼠糞便情況評(píng)估 根據(jù)文獻(xiàn)［4］方法，第21天和第28 天將其分別轉(zhuǎn)移到鋪有干凈濾紙的籠內(nèi)，每日相同時(shí)間段采集每只大鼠4 h糞便，在合適的高度對(duì)放有標(biāo)準(zhǔn)刻度尺的濾紙進(jìn)行圖像采集，通過(guò)ImageJ圖像處理軟件，計(jì)算大鼠4 h糞便面積。

4.6、微板法測(cè)定結(jié)腸組織Ach 含量 第28 天取大鼠組結(jié)腸組織后，使用組織勻漿機(jī)制備大鼠結(jié)腸組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取上清后依次加入各試劑制備6 組反應(yīng)液，每組4 管（空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管、對(duì)照管），最后再次取上清加至96孔板在酶標(biāo)儀550 nm波段處測(cè)定各孔OD值。記錄每管對(duì)應(yīng)OD值，計(jì)算結(jié)腸組織中的Ach含量。

4.7、硝酸還原酶法測(cè)定結(jié)腸組織NO 含量 第28 天取大鼠結(jié)腸組織后，使用組織勻漿機(jī)制備大鼠結(jié)腸組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取上清加入硝酸還原酶等試劑后滴入96 孔板，在酶標(biāo)儀550 nm 波段處測(cè)定各孔OD 值。記錄每管對(duì)應(yīng)OD值，計(jì)算每組結(jié)腸組織中的NO含量。

4.8、ELISA 測(cè)定大鼠結(jié)腸組織5-HT 含量 應(yīng)用ELISA定量測(cè)定大鼠結(jié)腸組織5-HT 的含量，在第28 天取大鼠結(jié)腸組織后，使用組織勻漿機(jī)制備大鼠結(jié)腸組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取上清后，使用純化的抗5-HT 捕獲抗體包被微孔內(nèi)壁的表層，制成固相的載體。檢測(cè)過(guò)程中依次加入各試劑樣品，最后通過(guò)讀取標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)樣品吸光度值計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊使用LSD 檢驗(yàn)，若方差不齊使用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、病理評(píng)價(jià)

在光學(xué)顯微鏡下，模型組大鼠與對(duì)照組比較，結(jié)腸組織樣本均無(wú)明顯的病理改變，基本可排除炎癥性病變，符合IBS-D 定義與組織學(xué)表現(xiàn)。同時(shí)，模型組大鼠病理切片未發(fā)現(xiàn)潰瘍病灶，提示束縛應(yīng)激的強(qiáng)度相對(duì)溫和，未造成應(yīng)激性潰瘍。病理評(píng)價(jià)結(jié)果提示造模成功。具體見(jiàn)圖1。

圖1 各組腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸病理變化（HE 染色 ×200）。A 為對(duì)照組（以等量生理鹽水灌胃），B 為模型組（造模完成后以等量生理鹽水灌胃），C 為葛根素低劑量組[造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃]，D 為葛根素高劑量組[造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃]

2、葛根素對(duì)IBS-D模型大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

在CRD 為60 mmHg 條件下，對(duì)照組大鼠AWR 評(píng)分為（0.53±0.02）分，模型組為（0.84±0.03）分，葛根素低劑量組（0.48±0.06）分，葛根素高劑量組（0.54±0.06）分；模型組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.293，P＜0.001）；葛根素低、高劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.811、9.338，均P＜0.001）。

3、葛根素對(duì)IBS-D模型大鼠4 h排便面積的影響

與對(duì)照組比較，第21、28 天模型組大鼠4 h 排便面積均顯著增加（均P＜0.01）；與模型組比較，第21、28 天葛根素低、高劑量組的4 h排便面積均顯著減少（均P＜0.01）。具體見(jiàn)表2。

表2 葛根素對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠4 h排便面積的影響（mm2，）

表2 葛根素對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠4 h排便面積的影響（mm2，）

注：對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃，模型組造模完成后以等量生理鹽水灌胃，葛根素低劑量組造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃，葛根素高劑量組造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃

第28天206.21±151.55 611.84±276.03 130.60±88.15 178.59±141.70 2.923 0.010 4.068 0.002 3.420 0.006組別對(duì)照組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組只數(shù)6 6 6 6 t值對(duì)照組比模型組P值對(duì)照組比模型組t值葛根素低劑量組比模型組P值葛根素低劑量組比模型組t值葛根素高劑量組比模型組P值葛根素高劑量組比模型組第21天249.70±106.83 654.22±120.21 351.73±89.60 337.60±135.31-6.161＜0.001 4.942＜0.001 4.285 0.002

4、葛根素對(duì)IBS-D 模型大鼠結(jié)腸組織Ach、NO、5-HT表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織Ach表達(dá)升高、NO含量降低、5-HT 表達(dá)升高（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素低劑量組的Ach 表達(dá)降低、NO 含量升高、5-HT 表達(dá)降低（均P＜0.05），葛根素高劑量組的Ach、5-HT 表達(dá)均降低（均P＜0.05）具體見(jiàn)表3。

表3 葛根素對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸組織乙酰膽堿、一氧化氮、五羥色胺表達(dá)的影響（）

表3 葛根素對(duì)腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸組織乙酰膽堿、一氧化氮、五羥色胺表達(dá)的影響（）

注：對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃，模型組造模完成后以等量生理鹽水灌胃，葛根素低劑量組造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃，葛根素高劑量組造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃

組別對(duì)照組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組只數(shù)6 6 6 6五羥色胺（μg/L）111.73±4.66 131.97±16.64 115.01±12.07 109.01±6.59-2.869 0.017 2.021 0.071 3.143 0.010 t值對(duì)照組比模型組P值對(duì)照組比模型組t值葛根素低劑量組比模型組P值葛根素低劑量組比模型組t值葛根素高劑量組比模型組P值葛根素高劑量組比模型組乙酰膽堿（μg/mgprot）1.56±0.52 3.67±0.87 2.65±0.87 2.26±1.05-5.126＜0.001 2.034 0.069 2.533 0.030一氧化氮（μg/mgprot）29.07±11.24 9.61±1.50 16.32±4.15 9.34±5.80 4.204 0.002-3.725 0.004 0.110 0.914

討 論

IBS-D 是以腹痛或腹部不適為主要癥狀的腸功能紊亂性疾病，IBS-D 的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究表明胃腸運(yùn)動(dòng)異常、內(nèi)臟高敏感性、腦-腸軸調(diào)節(jié)異常、腸道感染及免疫功能紊亂、腸道菌群紊亂、精神心理應(yīng)激、飲食及遺傳因素等都與其發(fā)病有關(guān)，目前主要采取對(duì)癥治療的方式進(jìn)行干預(yù)［1］。

IBS-D 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，其中醫(yī)病機(jī)多為脾運(yùn)失職，小腸無(wú)以分清泌濁，大腸無(wú)法轉(zhuǎn)化，水反為濕，谷反為滯，合污而下，則發(fā)泄瀉，核心病機(jī)在于脾虛濕盛。治療多以升陽(yáng)化濕、健脾止瀉為法。第10 版《中藥學(xué)》教材中記載葛根具有止瀉、生津、升陽(yáng)的功效，在臨床上多用于治療脾虛型泄瀉。葛根素是葛根的特有成分且含量最高，有研究指出葛根素對(duì)腸道平滑肌的舒張作用可能與其對(duì)腸神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)控有關(guān)［7-8］。李嬌嬌［9］的研究結(jié)果指出葛根素可以保護(hù)腸道組織結(jié)構(gòu)，預(yù)防結(jié)腸組織中5-HT 的濃度升高，從而影響腸道的蠕動(dòng)功能。張鳳杰［10］的研究指出葛根素對(duì)大鼠離體的平滑肌具有明顯的抑制作用。綜上所述，葛根素或可通過(guò)調(diào)控腸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)而對(duì)IBS-D 產(chǎn)生治療作用。故本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備大鼠慢性束縛應(yīng)激模型，觀察了葛根素對(duì)大鼠的相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)的影響。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，IBS-D 模型評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)是糞便情況的改變，腸、大鼠內(nèi)臟敏感性的改變以及病理學(xué)無(wú)器質(zhì)性改變［4，11-12］。本研究運(yùn)用慢性束縛應(yīng)激刺激，模型組大鼠出現(xiàn)有內(nèi)臟敏感性顯著升高、排便面積顯著增加的癥狀，且模型組病理學(xué)無(wú)器質(zhì)性改變，說(shuō)明IBS-D模型成功復(fù)制。

本實(shí)驗(yàn)中葛根素低、高劑量均能顯著減少I(mǎi)BS-D 大鼠的排便面積并降低內(nèi)臟敏感性，說(shuō)明葛根素對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的IBS-D大鼠具有一定的治療作用，

腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）由位于腸道壁內(nèi)的神經(jīng)元及其支持細(xì)胞所組成，為腸內(nèi)固有的神經(jīng)支配系統(tǒng)，支配腸道平滑肌的運(yùn)動(dòng)。膽堿能神經(jīng)元和非腎上腺素能非膽堿能（NANC）神經(jīng)元是ENS重要的組成部分。膽堿能神經(jīng)元合成釋放的Ach 是最主要的興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)。NANC 是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要包括NO、三磷酸腺苷、5-HT、血管活性腸肽等。從中選取Ach、NO、5-HT 3個(gè)相對(duì)具有代表性的神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

Ach 是膽堿能神經(jīng)元分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，屬于腸道的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。其受體主要為M 受體，其中M2 和M3 亞型主導(dǎo)腸道平滑肌收縮［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素低、高劑量均對(duì)IBS-D 大鼠結(jié)腸組織Ach 表達(dá)水平有明顯下調(diào)作用（均P＜0.05），提示葛根素可能通過(guò)抑制Ach 表達(dá)水平從而降低Ca2+釋放和底物蛋白發(fā)生磷酸化改善大鼠結(jié)腸平滑肌舒縮狀態(tài)。

NO 是平滑肌神經(jīng)肌肉接頭的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是一種腸動(dòng)力強(qiáng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。NO 由一氧化氮合成酶生成，NO 通過(guò)激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷，促進(jìn)平滑肌舒張［15-16］。Jang 等［17］的研究證明 NO 水平降低可直接導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)加快，縮短結(jié)腸中水的吸收時(shí)間，從而導(dǎo)致IBS-D 大鼠大便含水量的增加，內(nèi)臟敏感性增高，從而出現(xiàn)腹痛、腹瀉等癥狀。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠結(jié)腸組織中NO含量明顯降低，低劑量組葛根素可使大鼠結(jié)腸組織NO表達(dá)水平顯著增高，改善平滑肌收縮從而改變排便情況達(dá)到止瀉作用。

5-HT 是一種參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道活動(dòng)的神經(jīng)遞質(zhì)，在腸上皮細(xì)胞內(nèi)分布的5-HT可以控制腸平滑肌舒縮和分泌反射［18］。有研究提示 5-HT 通過(guò) 5-HT2B 受體直接作用于腸道黏膜上皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞調(diào)節(jié)結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)及分泌，5-HT 還可通過(guò)作用于外源性傳入神經(jīng)元上的5-HT3、5-HT4 受體，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性和腹部不適等腸道功能異常［19］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)葛根素可明顯降低大鼠結(jié)腸組織中5-HT 的濃度（P＜0.05），提示葛根素可能通過(guò)下調(diào)5-HT的表達(dá)水平從而發(fā)揮治療IBS-D的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立IBS-D 大鼠模型探究葛根素對(duì)IBS-D 腸道平滑肌神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)的影響，研究結(jié)果提示葛根素能夠顯著改善IBS-D 大鼠的內(nèi)臟高敏感性以及排便狀況，且從總體結(jié)果分析葛根素低劑量組取得的治療效果相對(duì)更顯著，提示在臨床應(yīng)用當(dāng)中應(yīng)注意葛根素的使用劑量。其機(jī)理或是通過(guò)上調(diào)結(jié)腸NO 表達(dá)水平，下調(diào)結(jié)腸Ach、5-HT 表達(dá)水平來(lái)對(duì)IBS-D 起到治療效果。葛根素影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的機(jī)制，是不是因?yàn)槠淠苡绊慐NS 的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)或通過(guò)影響腸道菌群從而導(dǎo)致腸神經(jīng)元功能改變，值得進(jìn)一步思考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突