季媛飛 楊陳 王敏 吳文燦 余波

外傷性視神經病變（Traumatic optic neuropathy,TON）是一種少見的疾病，常常由于頭部鈍器損傷后引起，可造成永久性的視力喪失[1-2]。早期患者通常表現(xiàn)為部分或完全的視力喪失、相對瞳孔傳入障礙、視盤正常和視野缺損[2]，后期出現(xiàn)視神經萎縮。目前，尚無有效的循證醫(yī)學治療方法，因為單純隨訪、糖皮質激素治療和視神經管減壓術都被證實對改善視力效果欠佳[3-5]。視神經損傷后，在免疫細胞和炎癥介質的相互作用下，組織病理學發(fā)生改變，包括軸突變性和視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞凋亡[3]。小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)的主要常駐免疫細胞，參與神經穩(wěn)態(tài)的維持和發(fā)展、損傷的應答和修復[6-7]，被認為是治療視神經疾病的重要細胞靶點[8]。在生理條件下，小膠質細胞數(shù)量較少，形態(tài)呈分枝狀，當受到炎癥、損傷或缺血時其可被激活，轉變?yōu)榘⒚装蜆樱瑪?shù)量增多，并做出迅速應答[9]。本研究通過建立視神經夾持模型來觀察不同時間點小鼠視神經小膠質細胞數(shù)目與形態(tài)的變化，了解視神經損傷后小膠質細胞的活化情況，為將來通過調控小膠質細胞激活狀態(tài)進行視神經損傷修復提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用由CX3CR1+/GFP小鼠（訂購于美國Jackson實驗室）和C57BL/6J WT小鼠雜交配得到的清潔級健康成年CX3CR1-/GFP轉基因雜交雄性小鼠32 只，8～16周齡，體質量18～25 g，其小膠質細胞均表現(xiàn)為GFP（+）。實驗期間飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學眼視光學院清潔級動物實驗室，自由飲水攝食，22 ℃室內溫度、濕度恒定，照明為12 h/12 h明暗交替。眼部檢查：雙眼角膜透明，屈光介質清，瞳孔等大等圓，對光反應靈敏，眼底無異常。應用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為4組：正常對照組，視神經損傷1、7、14 d組，每組8只。正常對照組不做任何處理，視神經損傷組均在左眼行視神經夾傷模型，右眼不予處理。本實驗嚴格按照溫州醫(yī)科大學動物倫理要求進行，并遵循溫州醫(yī)科大學批準的動物護理和使用方案（批號：wydw2019-0161）。

1.2 視神經損傷模型建立

鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉小鼠眼表，并用水合氯醛和烏拉坦麻醉藥（0.5 g烏拉坦，2.5 ml 10 %水合氯醛，7 ml蒸餾水混合）按0.15 ml/10 g進行腹腔注射麻醉。側臥固定，聚維酮碘消毒左眼結膜囊及眼周皮膚。在顯微鏡下，沿角膜緣剪開顳側球結膜，彎鑷將眼球輕推向鼻側，直顳鈍性分離充分暴露視神經，用恒定壓力的反向鑷夾持球后端視神經5 s，可見傷眼瞳孔散大固定、直接對光反射消失，眼內無出血。縫合結膜，將眼球恢復正常生理位置，眼表涂凡士林和氧氟沙星滴眼液，放置于37 ℃加熱板至蘇醒。

1.3 標本取材

在相應的時間點，水合氯醛和烏拉坦麻醉藥0.15 ml/10 g腹腔麻醉后，四肢固定于手術臺，開胸暴露心臟。止血鉗阻斷肺動脈和降主動脈，注射針插入左心室，右心耳開口放血。1.5 ml/min速度勻速灌注2 ml 37 ℃ 0.01 mmol/L PBS，預冷10 ml 4%PFA溶液。沿小鼠頸部剪下頭顱，去除顱骨和大腦，分離視神經與周圍組織，取出左眼視神經，避光固定于4% PFA溶液。

1.4 視神經冰凍切片

視神經避光置于4% PFA溶液，在4 ℃冰箱中固定4 h，再在30%蔗糖溶液中脫水過夜。用包埋劑包埋視神經后進行冰凍切片，切片厚30 μm，間隔1片貼于載玻片上，清洗包埋劑并封片。

1.5 激光共聚焦顯微鏡拍攝及小膠質細胞分析

由于CX3CR1-/GFP轉基因雜交小鼠的小膠質細胞自帶綠色熒光，因此無需染色，直接用Zeiss LSM880激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集即可觀察細胞數(shù)目和形態(tài)。每根視神經選取3片冰凍切片標本，在每片視神經切片距離眼球端500 μm處拍攝1張圖像。用共聚焦顯微鏡20×拍攝，截取200 μm×300 μm視野面積，用Image J軟件計數(shù)小膠質細胞數(shù)目，并計算單位面積的細胞密度（細胞個數(shù)/mm2）。用共聚焦顯微鏡63×拍攝，觀察小膠質細胞形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗研究。采用GraphPad Prism 7.04軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，滿足方差齊性，以表示，4組間的小膠質細胞數(shù)目比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 視神經小膠質細胞數(shù)目變化

正常對照組視神經小膠質細胞的數(shù)目為（438±16）個/mm2。視神經損傷1 d組小膠質細胞數(shù)目為（323±15）個/mm2，視神經損傷7 d組為（1 252±107）個/mm2，視神經損傷14 d組為（1 474±113）個/mm2。視神經損傷7 d組和14 d組的小膠質細胞數(shù)目與對照組和視神經損傷1 d組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），但是對照組和損傷1 d組比較以及損傷7 d組和損傷14 d組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 視神經小膠質細胞形態(tài)變化

正常對照組的視神經小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，胞體較小，分枝較多且細長、向四周伸展（見圖1A、E）。視神經損傷1 d后，小膠質細胞分枝數(shù)量減少，部分分枝朝向損傷部位，遠離損傷部位的分枝減少，細胞核形態(tài)變化不明顯（見圖1B、F）。損傷7 d組的視神經小膠質細胞大量激活，排列較紊亂，存在少量細胞聚集現(xiàn)象，分枝由長而細轉變成短而粗，且越靠近細胞核分枝越粗，分枝方向與視神經長軸方向平行，細胞核體積明顯增大（見圖1 C、G）。視神經損傷14 d組，視神經小膠質細胞排列雜亂，細胞聚集現(xiàn)象明顯，細胞核較大，突起數(shù)目較少，伸展范圍較短，與損傷7 d組類似（見圖1 D、H）。

3 討論

視神經是中樞神經系統(tǒng)的一部分，受到損傷后將不能再生。TON是一種由眼眶外傷引起的較少見但可造成永久視力喪失的疾病。TON的發(fā)生率占所有閉合性頭部外傷的0.5%～5%，占頜面部骨折的2.5%[1]。急性TON的臨床表現(xiàn)為部分或完全失明，相對瞳孔傳入障礙，視野缺損。疾病初期，視盤外觀無變化，但隨著時間的推移，視盤會呈現(xiàn)蒼白色。TON可導致軸突的變性和視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞（Retinal ganglion cells,RGCs）的凋亡，因此視神經損傷再生需要具備以下幾個條件：最大化RGCs內在再生能力；克服抑制視神經再生的外部環(huán)境；優(yōu)化再生軸突到達中樞。目前對于TON的病理生理和分子機制的了解仍然有限，尚無有效的治療方法[10-11]。

神經膠質細胞是視神經的重要組成部分，包括小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞，它們之間不斷地相互作用，形成一個強大而高效的網(wǎng)絡，對于維持神經元活性和結構穩(wěn)定發(fā)揮著關鍵作用[12]。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的主要常駐免疫細胞，占所有膠質細胞的10%～15%，在中樞神經系統(tǒng)生理和病理條件下都參與了各種保護和損傷作用。在生理條件下，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，胞體較小，分枝細長，動態(tài)伸縮的突起不斷地掃描周圍環(huán)境，同時釋放神經保護因子和抗炎因子，為神經元提供支持，參與程序性細胞凋亡，維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞在靜息狀態(tài)下高度活躍，其胞體一般保持固定，而突起不斷伸縮，清除積累的代謝產物和衰竭的組織成分，當相鄰的突起相互碰撞時，末端相互排斥[13]。急性損傷后，分枝狀小膠質細胞迅速被激活，形態(tài)變?yōu)榘⒚装蜆樱w增大，分枝縮短變粗，向損傷部位遷移[14]，并釋放各種因子，一方面清除受損凋亡的細胞，限制進一步損傷，另一方面引發(fā)持續(xù)激活，影響組織修復[15-16]。在神經退行性病變中，小膠質細胞釋放的線粒體碎片可調節(jié)反應性星形膠質細胞增生，進而加速神經元的損傷和死亡[17]，同時星形膠質細胞的功能喪失，也可引起中樞神經系統(tǒng)病理改變和神經退行性病變[18]。包繞軸突的髓鞘由少突膠質細胞形成，小膠質細胞的激活和星形膠質細胞的活化，可直接引起脫髓鞘/髓鞘再生[19]。相反，少突膠質細胞也能影響小膠質細胞的激活和存活，如少突膠質細胞表達的CD200可抑制小膠質細胞激活，SEMA3A可促進小膠質細胞凋亡[20]。

圖1.小鼠視神經損傷后不同時間點視神經小膠質細胞的分布與形態(tài)變化A-D：分別為正常對照組及ONC 1、7、14 d組小鼠視神經小膠質細胞（×20），紅色箭頭所示為小膠質細胞聚集；E-H：分別為正常對照組及ONC 1、7、14 d組小鼠視神經小膠質細胞（×63）Figure 1. Distributed and morphological changes of microglia in optic nerve of mice at different time points after optic nerve crush.A-D: control group,ONC 1 d group,ONC 7 d group and ONC 14 d group (×20).The red arrow shows the aggregation of microglia.E-H: control group,ONC 1 d group,ONC 7 d group and ONC 14 d group (×63).ONC,optic nerve crush.

本實驗通過視神經夾傷模型模擬外傷性視神經病變，這是一種用于研究視神經損傷后小膠質細胞功能的常用模型[21-22]。我們利用CX3CR1-/GFP轉基因雜交小鼠，其通過同源重組將CX3CR1基因替換為編碼增強綠色熒光蛋白（EGFP）的基因后，所有小膠質細胞都被熒光標記[23]，因此視神經冰凍切片后，用共聚焦顯微鏡可直接觀察小膠質細胞的形態(tài)與分布。

本研究觀察了小鼠視神經損傷后不同時間點視神經小膠質細胞數(shù)目及形態(tài)變化。我們發(fā)現(xiàn)正常對照組視神經小膠質細胞數(shù)量較少，形態(tài)為分枝狀的靜息狀態(tài)，分布均勻且稀疏，在視神經損傷1 d后小膠質細胞數(shù)目輕度減少，其胞體變化不明顯，部分細胞的分枝增粗，且分枝在損傷對側縮短，而在損傷側較長，說明視神經損傷急性期，可能部分小膠質細胞受損凋亡，存活的小膠質細胞處于激活初期，正在轉變?yōu)榘⒚装蜆?。視神經損傷7 d后，大部分小膠質細胞處于激活狀態(tài)，細胞數(shù)急劇增加，胞體直徑增大，分枝縮短增粗，呈現(xiàn)阿米巴樣，部分細胞出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。視神經損傷后14 d，小膠質細胞數(shù)目仍然較多，形態(tài)與損傷7 d組相比變化不大，提示其仍處于激活狀態(tài)。這些表現(xiàn)與既往的研究[14]相一致。

本研究存在進一步的提升空間，首先，可以設置更多時間點觀察視神經損傷后小膠質細胞激活和失活的變化；其次，可以觀察視神經不同部位小膠質細胞的激活狀態(tài)；最后，通過調控小膠質細胞的激活狀態(tài)進行視神經修復可能是值得進一步研究的方向。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明季媛飛：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與選題、設計及資料的分析和解釋；撰寫論文；修改論文中關鍵性結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。楊陳：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與資料的分析和解釋，根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。王敏：參與選題、設計；指導相關實驗工作和修改論文的結果、結論。吳文燦：參與選題、設計；指導相關實驗工作。余波：參與選題、設計及資料的分析和解釋；修改論文中關鍵性結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改