申夢園，吳蓓，段涵琪，李玉玲，陳鴻平，劉友平

(1.西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611130)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥葉，《中國藥典》(2005版)首次收載入藥，與杜仲皮相似，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨的功效[1-2]。杜仲葉主要成分為酚酸類、黃酮類以及環(huán)烯醚萜類等[3]。《中國藥典》(2020版)以綠原酸為杜仲葉質(zhì)量控制指標(biāo)性成分；此外杜仲葉中含有豐富的黃酮類成分，閆建昆等[4]從杜仲葉中分離得到圣草素等13個化合物，嚴(yán)穎等[5]人研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉中黃酮類成分含量高于其他部位；杜仲葉中的環(huán)烯醚萜類成分主要有杜仲醇、京尼平苷酸等[6]。目前，我國杜仲產(chǎn)業(yè)中作為藥用的杜仲皮全國推廣達(dá)到了95%[7]，與杜仲皮相比，杜仲葉可再生能力強(qiáng)，隨著杜仲以葉代皮的深入研究[8]，目前市場上以杜仲葉為原料的產(chǎn)品多種多樣，主要有杜仲葉飼料添加劑[9]、杜仲茶[10]、杜仲降壓片[11]等，杜仲葉的開發(fā)有十分廣闊的推廣空間和前景。目前已有杜仲葉指紋圖譜的相關(guān)報(bào)道[12]，近年來化學(xué)模式識別技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[13-16]，本文擬在建立杜仲葉指紋圖譜的基礎(chǔ)上結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對17批杜仲葉藥材成分的差異性進(jìn)行分析，以期為杜仲葉綜和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 主要儀器

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies有限公司)；UPTUO-I-1000TE超純水制備儀(成都超純科技有限公司)；BT125D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

綠原酸(批號：CHB190121)、異槲皮苷(批號：CHB180628)、蘆丁(批號：CHB190110 )和紫云英苷(批號：CHB181115)均購自成都克羅馬生物科技有限公司，各對照品純度均大于98%。乙腈(美國Fisher chemical，色譜純)；超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；甲醇(北京化工廠，分析純)。杜仲葉樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥葉(見表1)。

表1 杜仲葉樣品采收信息

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

精密稱定杜仲葉粉末1 g(過三號篩)，加 50%的甲醇 35 mL至錐形瓶中，于 100℃加熱回流提取1 h，后補(bǔ)足失重，濾過，吸取上清液，后過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 混合對照品溶液制備

稱取綠原酸1.01 mg、蘆丁0.24 mg、異槲皮苷0.66 mg、紫云英苷 0.23 mg，加50%甲醇定容至10 mL容量瓶，即得。

2.3 色譜條件

在唐芳瑞[12]等人考察的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，Agilent C18柱(4.6×250 nm，5 μm)；流動相0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，0-6 min：7%～14% B，6-30 min：14%～30% B，30-35 min：30%～70% B，流速0.8 mL/min；柱溫 30℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長360 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液，采用“2.3”項(xiàng)條件下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，在上述條件下混合對照品溶液保留時間的RSD均小于0.3%，峰面積的RSD均小于2%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取S1樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下進(jìn)樣。以10號峰異槲皮苷為參照峰，計(jì)算14個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，共有峰相對保留時間的RSD均小于0.3%，相對峰面積的RSD均小于2.5%，表明該儀器重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

以S1樣品為考察對象，參照 “2.3”所示的色譜條件分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.5%，相對峰面積的RSD均小于1.5%，結(jié)果表明該儀器穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012.130723版)建立指紋圖譜。選取S1為指紋圖譜的參照圖譜，采用平均數(shù)法，時間窗設(shè)為0.1 min，多點(diǎn)校正，得到17批杜仲葉指紋圖譜及對照指紋圖譜(見圖1)，確定共有峰為14個，并進(jìn)行相似度計(jì)算，從軟件分析得出似度結(jié)果(見表2)。

表2 17批杜仲葉相似度結(jié)果

圖1 17批杜仲葉(S1-S17)的HPLC指紋圖譜疊加圖及對照圖譜(R)

2.6 共有色譜峰指認(rèn)

通過與對照品比對，指認(rèn)出了4個共有峰，分別為綠原酸(3號峰)、蘆丁(7號峰)、異槲皮苷(10號峰)和紫云英苷(13號峰)，共有峰的指認(rèn)結(jié)果見圖2。

a 綠原酸對照品 b 蘆丁對照品 c 異槲皮苷對照品 d紫云英苷對照品

2.7 化學(xué)模式識別分析

2.7.1 聚類分析

應(yīng)用SPSS 24.0軟件，以共有峰的峰面積為變量，采用系統(tǒng)聚類法結(jié)合歐氏距離作為樣品的測度，可直觀地分析不同組樣本差異。其樹狀圖結(jié)果見圖3。當(dāng)歐式平方距離d=25 s時，17批杜仲葉聚為兩類。Ⅰ類為四川省通江縣(S3)和四川省涼風(fēng)村(S11)均為矮林杜仲葉。Ⅱ類包括其他產(chǎn)地(S1、S2、S4-S17)均為喬林杜仲葉。從圖3聚類分析結(jié)果來看，栽培方式可能是杜仲葉品質(zhì)存在差異的因素之一。

圖3 17批杜仲葉聚類分析

2.7.2 主成分因子分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析軟件將共有峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以主成分的特征值大于1和貢獻(xiàn)率為依據(jù)，進(jìn)行主成分因子分析。根據(jù)因子分析結(jié)果可得總方差解釋表(見表3)和碎石圖(見圖4)。共得到2個主成分因子，特征值分別為10.243、1.270，兩個主成分因子方差貢獻(xiàn)率分別為73.166%，9.072%共包含14個共有峰中82.238%的信息，因此可以通過提取的2個主成分對17批杜仲葉樣品進(jìn)行綜合評價。

表3 杜仲葉2個主成分因子總方差解釋變異

圖4 碎石圖

以Y1，Y2兩個主成分代表共有峰的主要信息，建立杜仲葉品質(zhì)綜和評價模型，共有峰與主成分之間的相關(guān)性表達(dá)式如下所示：Y1=-3.54×F1-4.31×F2+8.53×F3-2.72×F4-0.44×F5-0.04×F6+0.76×F7-0.11×F8+0.57×F9+0.23×F10+3.06×F11-3.98×F12-1.82×F13+2.73×F14+1.21×F15+1.75×F16-1.89×F17；Y2=-1.21×F1-0.89×F2-0.85×F3-2.36×F4+1.54×F5+0.92×F6+2.02×F7+1.62×F8+1.32×F9-0.46×F10-0.52×F11+0.26×F12+0.26×F13-2.23×F14-1.82×F15+2.11×F16+0.31×F17；結(jié)合1，2主成分方差貢獻(xiàn)率，得杜仲葉質(zhì)量綜合評價表達(dá)式：Y綜合得分=(Y1×73.166+Y2×9.072)/82.238，杜仲葉品質(zhì)綜合評價得分按照此表達(dá)式進(jìn)行計(jì)算，分高則排名靠前，表明杜仲葉的品質(zhì)越優(yōu)。結(jié)果見表4。

表4 綜合得分及排名

結(jié)合旋轉(zhuǎn)成分矩陣(表5)和旋轉(zhuǎn)后載荷圖(圖5)分析可知F2-F14在Y1上的貢獻(xiàn)最大，F(xiàn)1在Y2上的信息貢獻(xiàn)最大。

表5 旋轉(zhuǎn)后因子負(fù)荷矩陣

圖5 旋轉(zhuǎn)后共有峰載荷圖

上述綜和排名及聚類分析結(jié)果表明，四川省通江縣和四川省涼風(fēng)村(S3、S11)品質(zhì)明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地。

2.7.3 主成分分析

將各樣品共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，通過主成分分析(PCA)來初步判斷各樣品的聚集情況。PCA模型中R2X=0.918，Q2=0.755，由PCA得分圖可看出，S3和S11明顯聚為一類，其余產(chǎn)地的杜仲葉聚為一類。結(jié)果見圖6。

圖6 PCA得分圖

2.7.4 正交偏最小二乘法判分析

將指紋圖譜中所得到的樣品共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，OPLS-DA擬合的模型R2X=0.878，R2Y=0.906，Q2=0.537，均>0.5可以作為17批杜仲葉指紋圖譜的模式識別方法。杜仲葉樣品OPLS-DA得分圖見圖7。以VIP>1為存在差異性的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見圖8，從結(jié)果可知VIP>1的成分有F3(綠原酸)，F(xiàn)6，F(xiàn)10(異槲皮苷)，F(xiàn)12。

圖7 OPLS-DA得分圖

圖8 OPLS-DA的VIP圖

3 討論

本研究采用HPLC法建立了17批杜仲葉的指紋圖譜，方法簡便，可重復(fù)性強(qiáng)，指紋圖譜中各成分吸收強(qiáng)度高、各峰分離度良好且基線平穩(wěn)。指紋圖譜相似度均大于0.899表明17批杜仲葉相似度良好；聚類分析將17批杜仲葉樣品分為2大類，其中四川省通江縣和四川省涼風(fēng)村杜仲葉聚為一類，通過主成分因子分析結(jié)果進(jìn)一步證明與其他產(chǎn)地杜仲葉相比較四川省通江縣和四川省涼風(fēng)村杜仲葉質(zhì)量較優(yōu)。通過主成分分析及正交偏最小二乘法判別分析篩選出了4個影響杜仲葉藥材質(zhì)量的差異成分，產(chǎn)生這種差異的可能原因有地理及氣候條件、采收時間、樹的生長年限、栽培模式等多種因素，因此有待于通過是固定采收地點(diǎn)、采收時間、樹齡及品種進(jìn)一步深入研究。本研究在體現(xiàn)藥材品質(zhì)一致性的同時也體現(xiàn)化學(xué)成分的差異性，杜仲葉質(zhì)量控制提供科學(xué)參考。本課題尚存在不足，杜仲葉矮林栽培樣本來源相對較少，后期有待于利用代謝組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步分析喬林及矮林栽培模式下杜仲葉的品質(zhì)差異，為杜仲葉的合理栽培和利用提供依據(jù)。