劉詩(shī)蓉，王紅蘭，楊萍，孫輝，蔣舜媛，蔣桂華

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，四川 成都 610065)

大宗中藥材半夏為天南星科植物半夏(Pinelliaternate(Thunb.) Breit.)的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)等功效[2]。四川內(nèi)江和遂寧為川半夏傳統(tǒng)的產(chǎn)區(qū)，據(jù)實(shí)地調(diào)查，半夏的連作障礙是制約其規(guī)模化發(fā)展的最主要因素。半夏連作障礙表現(xiàn)在植株生長(zhǎng)不良和病蟲害爆發(fā)嚴(yán)重，產(chǎn)量降低，尋找有效緩解半夏連作障礙的農(nóng)藝措施或消減技術(shù)已成為其生產(chǎn)上亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[3]。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要采用農(nóng)業(yè)生態(tài)防治(輪作和間套作、添加土壤改良措施改善土壤結(jié)構(gòu)、pH和土壤微生態(tài)環(huán)境)，植物調(diào)控防治(抗病蟲害品種的研發(fā)與應(yīng)用)，生物防治(施用拮抗菌劑、微生物菌劑)和物理防治(土壤消毒、灌溉洗鹽)等措施改善作物連作障礙[4]。

目前，半夏生產(chǎn)主要通過(guò)種莖消毒、土壤消毒和輪作等措施來(lái)緩解半夏連作障礙。這些處理方式可在一定程度上改善半夏根腐病的問(wèn)題，但對(duì)土壤生態(tài)平衡影響小，且輪作周期長(zhǎng)[5-8]。微生物區(qū)系的改變是半夏連作障礙形成的重要原因，目前有關(guān)半夏連作土壤改良方面的研究鮮有報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)比2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰等4種土壤改良措施，測(cè)定連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及半夏形態(tài)學(xué)及藥材產(chǎn)量等指標(biāo)，闡明不同土壤改良措施對(duì)半夏生長(zhǎng)及根際微生態(tài)環(huán)境的影響，探索半夏連作障礙的最佳土壤改良措施，為緩解或消除半夏連作障礙提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

田間試驗(yàn)在四川天貝生態(tài)農(nóng)業(yè)中藥材試驗(yàn)基地內(nèi)進(jìn)行，基地座落于內(nèi)江市，東經(jīng)29°49′，北緯104°85′，海拔325 m左右，為亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，冬暖夏熱，雨量適中，年相對(duì)濕度約80%；年均降雨量約920 mm，該區(qū)域地形以低山丘陵為主。實(shí)驗(yàn)地土壤為紫紅色砂質(zhì)泥巖母質(zhì)發(fā)育的中性至石灰性紫色土，為壤質(zhì)土，其砂粒(粒徑為0.05～2 mm)、粉粒(粒徑為0.002～0.05 mm)及黏粒(粒徑<0.002 mm)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為21%、51%和28%。本試驗(yàn)所用地塊均為新開墾的土壤，實(shí)驗(yàn)開展前，持續(xù)在同一塊地栽種半夏，形成連作2茬的處理樣地并按生態(tài)種植模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)栽培管理[9]。經(jīng)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)開展前連作2茬地土壤養(yǎng)分為全磷317.37 mg/kg，速效磷30.32 mg/kg、全氮97.97 mg/kg、速效氮13.99 mg/kg、速效鉀75.83 mg/kg、有機(jī)質(zhì)5.77 g/kg、全鉀12.89 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料及儀器

半夏種莖來(lái)自于重慶市大足縣，直徑為1.0～1.5 cm，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院周毅研究員鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit．的新鮮塊莖；2%生物炭(廣東炭都生物科技控股有限公司)；微生物菌劑(濟(jì)南源鵬化工有限公司)；生物有機(jī)肥(德強(qiáng)生物股份有限公司)；草木灰(四川天貝生態(tài)農(nóng)業(yè)中藥材試驗(yàn)基地)；DNA 提取試劑盒(PowerSoil? DNA Isolation kit)；SynergyHTX酶標(biāo)儀(Gene Company Limited 基因有限公司)；Legend Micro 21高速離心機(jī)(EPPENDORF有限公司)；G560E振蕩器(SI有限公司)。

1.3 大田實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)頭茬(CK1)、連作對(duì)照(CK2)、連作2茬地添加2%生物炭(A)、連作2茬地添加微生物菌劑(B)、連作2茬地添加生物有機(jī)肥(C)和連作2茬地添加草木灰(D)6個(gè)處理，具體操作方法如表1所示。小區(qū)布置采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每一處理設(shè)置3次平行，小區(qū)與小區(qū)之間留30 cm間距，深度為10 cm，小區(qū)面積為3 m×1.2 m=3.6 m2。種莖在播種前用惡霉靈、春雷霉素和霜霉威鹽按一定比例加水稀釋成一定濃度，浸種30 min，晾干，并于播種前將同濃度藥液噴淋于土壤表層深翻進(jìn)行土壤消毒。半夏于2019-09-03播種，覆土深度為8 cm。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程田間管理措施均保持一致。

表1 緩解半夏連茬效應(yīng)的土壤改良方法

1.4 樣品采集

于半夏塊莖膨大期(播種后60 d)按“S”布點(diǎn)法采集各小區(qū)半夏植株，測(cè)其生理指標(biāo)。于成熟期(播種后90 d)測(cè)其藥材產(chǎn)量，并收集半夏根際土壤，置于-80 ℃液氮罐中保存，用于根際土壤微生物群落高通量測(cè)序分析。

2 測(cè)定項(xiàng)目

2.1 半夏生理性狀及產(chǎn)量

半夏葉長(zhǎng)、葉寬、最長(zhǎng)須根長(zhǎng)和株高用直尺測(cè)定(精確到0.1 cm)；珠芽直徑、莖粗、塊莖直徑用游標(biāo)卡尺測(cè)定(精確到0.1 mm)；于每個(gè)小區(qū)拉出1 m2的樣方，并將里面全部半夏塊莖進(jìn)行采挖，用電子天平測(cè)定鮮重(精確到 0.01 g)。

2.2 土壤微生物測(cè)序分析

取0.25 g土壤樣品，按試劑盒(PowerSoil? DNA Isolation kit)操作流程，提取土壤總DNA，分別采用引物27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)對(duì)細(xì)菌及真菌的rRNA基因的V1-V9區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，采用ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 對(duì)真菌的rRNA基因的V1-V9區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)Barcode區(qū)分樣品序列，并對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除特異性擴(kuò)增序列及嵌合體。在相似性 97% 的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類(USEARCH，version 10.0)，以測(cè)序所有序列數(shù)的 0.005%作為閾值過(guò)濾 OTU。使用Usearch軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，并基于Silva(細(xì)菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。計(jì)算群落多樣性Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)，并基于物種分類對(duì)門水平和屬水平群落繪制條形圖。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SPSS 20.00分析數(shù)據(jù)；采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Excel 2016繪制圖形。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同改良措施對(duì)半夏生理性狀及產(chǎn)量的影響

不同改良措施對(duì)半夏生理性狀的影響見(jiàn)表2所示，與頭茬對(duì)照相比，半夏連作降低了葉片長(zhǎng)、葉片寬、株芽直徑、莖粗、株高、塊莖直徑、莖須根數(shù)和最長(zhǎng)須根數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)。與連作對(duì)照相比，2%生物炭處理抑制了半夏葉片生長(zhǎng)，且在田間其葉片呈淺黃色；生物有機(jī)肥和草木灰處理可促進(jìn)半夏根系的發(fā)育。微生物菌劑不僅促進(jìn)半夏葉長(zhǎng)的伸長(zhǎng)，珠芽的生長(zhǎng)，還可促進(jìn)塊莖的發(fā)育以及根系的生長(zhǎng)。不同土壤改良措施對(duì)半夏產(chǎn)量的影響如圖1所示。頭茬處理(CK1)下半夏產(chǎn)量最高，為0.456 kg/m2。連作后不同土壤改良措施下半夏產(chǎn)量均顯著下降，最高下降82.73%。與連作對(duì)照(CK2)相比，生物有機(jī)肥和草木灰處理下半夏產(chǎn)量分別增加3.11%和15.35%，而2%生物炭和微生物菌劑處理則分別下降44.86%和5.66%。結(jié)合半夏塊莖膨大期形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析，2%生物炭處理在該時(shí)期顯著抑制半夏生長(zhǎng)，這可能是導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低的重要原因。

表2 不同土壤改良措施下半夏莖膨大期生理特征

圖1 不同土壤改良措施對(duì)半夏產(chǎn)量的影響

3.2 不同改良措施對(duì)根際土壤微生物多樣性的影響

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是一種衡量物種豐度的指數(shù)，即表示物種數(shù)量的多少，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)值越大，即表示物種豐度越大。Shannon指數(shù)則能反映樣品中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)越大則種類越多，物種越豐富。不同處理下半夏根際土壤細(xì)菌和真菌的多樣性參數(shù)值見(jiàn)表3。對(duì)于土壤中的細(xì)菌，微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處理下其ACE指數(shù)均高于連作對(duì)照，說(shuō)明這3種改良措施可提高半夏連作土壤中細(xì)菌的物種豐度。微生物菌劑和生物有機(jī)肥處理下細(xì)菌Shannon指數(shù)值高于連作對(duì)照，說(shuō)明微生物菌劑和生物有機(jī)肥可增加連作土壤中細(xì)菌多樣性。對(duì)于土壤中的真菌，微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處理下其Chao1和ACE指數(shù)均高于連作對(duì)照，說(shuō)明微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處均可降低真菌的物種豐度。2%生物炭、生物有機(jī)肥和草木灰均降低了連作土壤中真菌的Shannon值，表明其降低了連作土壤中真菌多樣性。

表3 不同土壤改良措施對(duì)半夏根際土壤微生物多樣性的影響

3.3 不同改良措施對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

不同改良措施對(duì)根際土壤細(xì)菌在門水平的影響見(jiàn)圖2所示，土壤中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌群落包括Proteobacteria(變形菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)。與連作對(duì)照相比，生物有機(jī)肥和草木灰均增加了土壤中變形菌門細(xì)菌的豐度，而2%生物炭和微生物菌劑均減少了變形菌門細(xì)菌的豐度。與頭茬對(duì)照相比，連作對(duì)照增加了酸桿菌門細(xì)菌豐度，而生物有機(jī)肥和草木灰均可降低酸桿菌門細(xì)菌在連作土壤中的豐度。連作降低了擬桿菌門細(xì)菌在半夏根際土壤中的豐度，而2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均增加了擬桿菌門細(xì)菌在連作土壤中的豐度，且增加程度草木灰>微生物菌劑>生物有機(jī)肥>2%生物炭。連作增加了芽單胞菌門細(xì)菌在半夏根際土壤中的豐度，而2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均減少其在連作土壤中的豐度，且減少程度草木灰>微生物菌劑>生物有機(jī)肥>2%生物炭。

圖2 不同土壤改良處理下半夏根際土壤細(xì)菌門水平群落組成

不同改良措施對(duì)根際土壤真菌在門水平的影響見(jiàn)圖3所示，土壤中優(yōu)勢(shì)的真菌群落包括Ascomycota(子囊菌門)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)、Chytridiomycota(壺菌門)、Mortierellomycota(絲孢菌門)和Mucoromycota(毛霉門)。連作增加了子囊菌門真菌的豐度，2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均可降低其在連作土壤中的豐度，其減少幅度為2%生物炭>微生物菌劑>生物有機(jī)肥>草木灰。連作降低了擔(dān)子菌門真菌的豐度，微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均可增加擔(dān)子菌門真菌在連作土壤中的豐度，其在土壤中的豐度生物有機(jī)肥>微生物菌劑>草木灰。同時(shí)，連作還降低了壺菌門真菌的豐度，2%生物炭、微生物菌劑和生物有機(jī)肥均可增加其在連作土壤中的豐度，且在各處理中的豐度2%生物炭>微生物菌劑>生物有機(jī)肥。對(duì)于絲孢菌門真菌，連作增加其豐度，而2%生物炭、生物有機(jī)肥和草木灰則降低其豐度，降低幅度順序?yàn)樯镉袡C(jī)肥>草木灰>2%生物炭。對(duì)于毛霉門真菌，連作增加了毛霉門真菌的其豐度，2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰則均降低其豐度，降低幅度2%生物炭>生物有機(jī)肥>草木灰>微生物菌劑。

圖3 不同土壤改良處理下半夏根際土壤真菌門水平群落組成

不同改良措施對(duì)根際土壤細(xì)菌在種水平的影響見(jiàn)圖4所示，2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處理均可以降低(果膠桿菌)的豐度，其在土壤中的豐度大小順序?yàn)槲⑸锞鷦?2%生物炭<草木灰<生物有機(jī)肥<頭茬對(duì)照<連作對(duì)照。對(duì)于Acinetobacterrudis(魯?shù)纤共粍?dòng)桿菌)，其在草木灰處理中豐度最大達(dá)到23.36%，其他處理幾乎為零。

圖4 不同土壤改良處理下半夏根際土壤細(xì)菌種水平群落組成

不同改良措施對(duì)根際土壤真菌在種水平的影響見(jiàn)圖5所示，連作增加了Arthrobotrys oligospora(少孢節(jié)叢孢菌)的豐度。不同處理下Arthrobotrys oligospora(少孢節(jié)叢孢菌)豐度的順序?yàn)椴菽净?連作對(duì)照>微生物菌劑>2%生物炭>生物有機(jī)肥>頭茬對(duì)照。對(duì)于Mortierellaalpina(高山被孢霉)，連作增加其豐度，而2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處理則降低其在連作土壤中的豐度，不同處理下其豐度大小順序?yàn)檫B作對(duì)照>微生物菌劑>2%生物炭>草木灰>生物有機(jī)肥>頭茬對(duì)照。

圖5 不同土壤改良處理下半夏根際土壤真菌種水平群落組成

4 討論

土壤微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能多樣性對(duì)維持土壤系統(tǒng)健康有非常重要的作用，而土壤微生物結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定性取決于微生物多樣性[10]。隨連作年限的增加，土壤微生物群落多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化[11]。已有研究證實(shí)，土壤養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化受微生物影響[12]，而微生物種群組成失衡會(huì)降低土壤質(zhì)量和作物產(chǎn)量[13]。王覺(jué)等[14]研究表明半夏連作后，真菌成為土壤優(yōu)勢(shì)種群，即土壤有由細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，一般認(rèn)為真菌型土壤是地力衰竭的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均可顯著提升半夏連作土壤中細(xì)菌的物種豐度。微生物菌劑和生物有機(jī)肥均可增加連作土壤中細(xì)菌多樣性。微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處均可降低真菌的物種豐度。2%生物炭、生物有機(jī)肥和草木灰均可降低連作土壤中真菌多樣性。不同土壤修復(fù)措施通過(guò)降低真菌物種多樣性提高細(xì)菌多樣性起到恢復(fù)連作土壤微生物群落多樣性的作用。

酸桿菌門多存在于營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中，其豐富度與土壤質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[15]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連作增加了酸桿菌門細(xì)菌豐度，而生物有機(jī)肥和草木灰均可通過(guò)降低酸桿菌門細(xì)菌在連作土壤中的豐度進(jìn)而改善土壤質(zhì)量。高水平的子囊菌門菌群與病害發(fā)生有著密切的關(guān)系[16]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰均可降低其在連作土壤中的豐度，其減少幅度2%生物炭>微生物菌劑>生物有機(jī)肥>草木灰。Pectobacteriumaroidearum(果膠桿菌)是一種致病菌，2%生物炭、微生物菌劑、生物有機(jī)肥和草木灰處理均可以降低Pectobacteriumaroidearum(果膠桿菌)的豐度，且微生物菌劑修復(fù)效果優(yōu)于其他修復(fù)措施。

單從產(chǎn)量分析草木灰和微生物有機(jī)肥均對(duì)連作半夏生長(zhǎng)及根際微環(huán)境產(chǎn)生有益影響，且以草木灰為優(yōu)，微生物有機(jī)肥次之。其他改良措施對(duì)半夏連作土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)亦產(chǎn)生有益影響，但對(duì)半夏生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制效應(yīng)，后期可考慮調(diào)節(jié)使用量和配方施肥進(jìn)一步改善連茬效應(yīng)。