毛 霞，李曉春，劉國華，陳 剛★

（1.江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400；2.宜春市科學院，江西 宜春 336000）

千年桐（Vernicia montana）又稱木油桐是大戟科（Euphorbiaceae）油桐屬（Vernicia）落葉喬木，原產于我國，種植范圍比較廣泛，栽培歷史悠久[1]。由于其果皮基部呈皺狀褶皺，經濟價值高且使用壽命相對較長，因此而得名皺桐，又稱木千年桐、廣東千年桐、金臣樹。千年桐是重要的油料植物，其干種子的含油量大約為60%~70%，極具能源開發(fā)應用前景，能發(fā)展成生物質能源林，被認為是最理想的替代柴油的微量生物化學原料之一[2-3]。在生物量生長方面，千年桐具有生長快，耐寒等優(yōu)秀品質，作為用材樹種具有良好的研發(fā)潛能[4-5]。但是，我國對于千年桐能源樹種的資源相對較少，桐油在國際市場上供不應求，而且桐油的主要用途和覆蓋面廣大，提高千年桐單位面積產量已顯得十分迫切[6-7]。

千年桐作為雌雄異株植物，約有1/3的植株不結果[1]。在生產上，不結果的雄株比重過大嚴重影響單位面積產量的提高，因此在配置前期如何識別千年桐幼苗的雌雄，是當前千年桐種植和生產上亟需解決的問題。早期相關學者對千年桐雌雄植株的生理指標、酶活性進行了測定；同時，利用化學染色法對千年桐成年植株的雌雄進行鑒定[8-11]。近年來，對于木本雌、雄異株植物的生物學差異研究主要從雌、雄株的形態(tài)解剖學[12-13]、生理學[14-15]、分子生物學[16-17]、化學防御[18-19]以及激素對性別的調控[20]等方面進行，為雌、雄株在生產實踐中的選擇性應用及理論研究提供參考[21]。而形態(tài)學研究是生化分析取樣的基礎，有助于植物早期雌雄的鑒定，也是鑒別植物雌雄最直觀、最直接的方法。相關研究表明樹齡較大的乳香黃連木（Pistacia lentiscus）雄株植株較高，冠層體積和葉面積指數值較大[22]；連香樹(Cercidiphyllum japonicum)雄株葉長、葉寬等都高于雌株[23]。

文章對不同千年桐天然林分進行踏查，研究不同海拔林分形態(tài)指標的差異，并且以天然林成年千年桐的雌、雄株為試驗材料，研究了雌雄株在形態(tài)及生理學上的差異，旨在為千年桐的保護和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西省宜春市明月山，地處江西省宜春市袁州區(qū)西北部（27°54′N，114°18′E），屬中亞熱帶季風型濕潤氣候區(qū)，氣候資源豐富，年平均氣溫12℃~15℃，無霜期307 d，雨量充沛，年降水量1 500~1 800 mm；光熱豐富，年日照時數1 400~1 900 h，氣候類型多樣，境內地勢高低不一。

1.2 試驗材料與樣品采集

試驗調查了位于袁州區(qū)的6個天然千年桐群落，每個林分單株數量在50~300株之間。選取的調查對象為5月處于開花期的千年桐雌雄單株。

于2020年5月13日進行采樣，選取的材料為樣地吼里布村中8年生的已開花的生長健康、無病蟲害的千年桐雌雄株各30株（雌株：♀；雄株：♂），隨機選取每個植株向南面生長健康、無病蟲害的葉片5片及離葉片上下各5 cm處的韌皮部，寬度為5 cm。將采回的葉片、韌皮部，洗凈、擦干裝入含有吸水硅珠的自封袋中，置于－80℃超低溫冰箱保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 千年桐雌雄株野外調查

對天然千年桐群體主要分布區(qū)（江西省宜春市袁州區(qū)）人為干擾較少的河岸帶進行種群調查。在千年桐每個主要分布區(qū)均設置5個20 m×30 m的樣方，各樣方間隔20 m，于千年桐花期對所有能區(qū)分雌雄的千年桐植株進行標記，并通過成對取樣法選定生長狀況良好、無病蟲害的雌雄單株，在2020年11月對植株進行胸徑（胸徑尺）、冠幅（冠層儀塞亞斯SYSGC2000）、樹高（測高儀雷力SLD-300G）、樹齡（生物錐法）的測定。

1.3.2 指標測定

可溶性糖和淀粉含量的測定采用蒽酮測試法[24]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍比色法[24]；SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[24]；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[25]。

1.4 數據統(tǒng)計與處理

使用Excel 2016和Origin 2017進行數據統(tǒng)計、作圖分析。雌雄比偏離1∶1假設的顯著性程度采用卡方檢驗確定；用單因素方差分析檢驗組間差異顯著性，上述分析使用SPSS 20.0完成。表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 天然千年桐林分種群雌雄比

本次踏查了6個地區(qū)（表1），處于花期的千年桐單株共計316棵，其中雌株共113棵，占比35.75%；雄株共203棵，占比62.24%，雌雄比為0.63±0.29，總群體顯著偏雄（χ2=18.00，P＜0.01）。根據調查結果發(fā)現(xiàn)，每個千年桐天然林樣地中，雄性單株數量均多于雌性單株數量，其中石溪水庫、水口村和袁梅村的雌雄比顯著偏離1∶1，雄株偏多，χ2值分別于11.08（P＜0.01）、25.79（P＜0.01）、4.41（P＜0.01）；僅東壩沖的天然林中雌雄株數量相同。

表1 千年桐天然林各樣地雌雄株結構參數Tab.1 Structural parameters of male and female plants in each site of natural forest of V.montana

2.2 千年桐雌雄株形態(tài)學差異

雌雄異株植物是自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于雌雄個體對環(huán)境的適應性不同而導致二者在生理、形態(tài)、生活史以及群體結構上存在差異。但由表2可以看出，同一踏查地的千年桐的胸徑、樹高、冠幅、樹齡在雌雄植株間差異不顯著（P＞0.05）。盡管里木地區(qū)千年桐雌雄株的冠幅均值相差較大（♀：14.79±7.50m；♂：23.45±17.76m），但差異不顯著（P＞0.05），說明里木的千年桐群體間個體差異較大。表2中6個踏查地的千年桐雌雄株的樹齡按照均值從大到小排序為：里木、水口村、袁梅村、東沖壩、吼里布村、石溪水庫，由此可見里木群體間個體差異較大的原因可能是由于存在大齡植株。

表2 天然千年桐林分雌雄單株信息表Tab.2 Information table of male and female monocultures in natural forest stands of V.montana

以不同踏查地為研究對象，發(fā)現(xiàn)千年桐雌雄株形態(tài)指標存在差異，推測導致這一結果的原因是受到了土壤條件、氣候條件、人為干擾條件等的影響；其中里木、水口村、袁梅村的胸徑、冠幅、樹高的均值，均高于其他3個踏查地，可能與群體間年齡相關性較大。

2.3 天然千年桐林分雌雄株形態(tài)指標相關性分析

由前述可知，不同踏查地的海拔存在差異，林分間形態(tài)指標也存在差異，推測可能與生境、樹齡存在相關性。由此對海拔、植株數量、胸徑、冠幅、樹高、樹齡指標進行相關性分析（表3），可以看出千年桐雌雄植株間的形態(tài)指標相關性存在差異，且各形態(tài)指標、樹齡、海拔間兩兩相關。

表3 千年桐雄株形態(tài)指標、樹齡及海拔間的兩兩相關性Tab.3 Correlation between morphological indicators of V.Montana

千年桐雌株的數量與海拔、形態(tài)指標、樹齡兩兩之間相關性差異不顯著。對雌株的形態(tài)指標與海拔的相關性分析中，僅樹高與海拔相關性不顯著（P＞0.05），其中胸徑、冠幅、樹齡均與海拔呈負相關性，且差異極顯著（P＜0.01）；植株數量與千年桐形態(tài)指標的相關性不顯著；而胸徑、樹高、年齡兩兩相關性均為正相關，且差異極顯著（P＜0.01）。

雄株的數量僅與樹齡無相關性，與胸徑、冠幅均呈正相關，差異極顯著（P＜0.01）；與樹高呈負相關（P＜0.05）。對雄株的形態(tài)指標與海拔的相關性分析中，僅冠幅與海拔相關性不顯著（P＞0.05），與其他形態(tài)指標均為正相關（P＜0.01）。與雌株不同的是，雄株的數量與千年桐的胸徑、冠幅、樹高均呈正相關性（P＜0.01）；千年桐其他形態(tài)指標兩兩相關性也均呈正相關（P＜0.01）。

綜上，千年桐雌雄株形態(tài)指標、海拔、樹齡間的相關性根據雌雄不同而存在差異；同性植株的胸徑、樹冠、樹高兩兩相關性均為極顯著的正相關（P＜0.01）。

2.4 千年桐雌雄株養(yǎng)分含量差異研究

由圖1可知，千年桐雌雄植株葉片中的養(yǎng)分含量均差異顯著（P＜0.05），且千年桐雌株的葉片中可溶性糖含量及淀粉含量均顯著高于雄株葉片的含量；而葉片可溶性蛋白含量則為雄株＞雌株。千年桐雌雄植株的韌皮部養(yǎng)分中僅可溶性蛋白含量存在顯著差異（P＜0.05）。

圖1 千年桐雌雄株不同組織養(yǎng)分含量差異Fig.1 Differences in nutrient contents of different tissues of male and female plants of V.Montana

對于同性不同組織中養(yǎng)分含量的差異而言，僅雌株中可溶性糖含量及可溶性蛋白含量存在差異顯著（P＜0.05），雄株的葉片及韌皮部養(yǎng)分均差異不顯著（P＞0.05）；并且均表現(xiàn)為同性中葉片養(yǎng)分含量高于韌皮部中養(yǎng)分含量。

2.5 千年桐雌雄株酶活性差異研究

由圖2可知，千年桐雌雄株的葉片中各類酶的酶活性均為雌株＞雄株，但僅POD、CAT酶活性存在顯著差異（P＜0.05），其中雌株葉片中POD酶活性（183.09±21.44 U/mg prot）遠大于雄株中POD酶活性（59.95±18.02 U/mg prot）。對于植株的韌皮部而言，雌株中各類酶的酶活性均高于雄株，但僅SOD、POD酶活性在雌雄株中存在顯著差異（P＜0.05），且雌株的韌皮部中POD酶活性（179.95±31.42 U/mg prot）遠大于雄株（73.12±25.71 U/mg prot）。

圖2 千年桐雌雄株不同酶活性差異Fig.2 Differences in the activity of different enzymes of different tissues of male and female plants of V.Montana

通過比較同性不同組織中酶活性發(fā)現(xiàn)，雄株的葉片及韌皮部中僅MDA含量存在顯著差異（P＜0.05），其他酶活均差異不顯著（P＞0.05）；雌株的葉片及韌皮部中僅CAT含量存在顯著差異（P＜0.05），其他酶活均差異不顯著（P＞0.05）。

3 結論與討論

3.1 千年桐種群的雌雄比結構

雌雄異株植物種群性別間的偏倚可能直接影響種群的繁育過程，造成有性生殖效率降低，進而可能改變植物種群的性別結構和動態(tài)[26-27]?，F(xiàn)有理論認為大多數雌雄異株植物雌雄比偏雌更為常見[28-30]，如對細枝柃（Eurya loquaiana）的研究發(fā)現(xiàn)其雌雄比為1.43[31]。本文研究表明：每個千年桐天然林樣地中，雄性單株數量均多于雌性單株數量，其中石溪水庫、水口村和袁梅村的雌雄比顯著偏離1∶1，植株偏雄。有學者認為長壽命的灌木和喬木的種群性比通常偏向于雄，對黃連木（Pistacia chinensis）的研究也體現(xiàn)了種群性比更加偏向雄[32]，與本文研究一致。引起種群中雌雄異株植物性別依賴的繁殖差異可能由于雌樹付出的繁殖代價高于雄樹，以致種群性比偏雄性。同時，對青楊（Populus cathayana）的研究表明雌雄株性比隨海拔梯度的增加而增加[33]，也可能是石溪水庫、水口村種群雌雄比顯著偏離1∶1的原因。

雌樹通過降低營養(yǎng)生長將更多的生物量分配于繁殖過程，因此同一植物種群雄樹的平均胸徑通常大于雌樹[29]；而同一踏查地的千年桐胸徑、樹高、冠幅、樹齡在不同性別的植株間差異不顯著（P＞0.05），可能與千年桐植株的樹齡較小、雌雄分化尚不顯著相關。同時，林分密度、發(fā)育環(huán)境的物理性質及氣候變異等均會導致種群性比發(fā)生改變[33-37]。

3.2 千年桐雌雄株間形態(tài)學差異

同一踏查地千年桐的胸徑、樹高、冠幅、樹齡在雌雄植株間差異不顯著（P＞0.05），對連香樹的研究中也表明性別對其胸徑無顯著影響，但對株高有顯著影響[38]。不同踏查地的海拔存在差異，林分間形態(tài)指標也存在差異。對海拔、植株數量、胸徑、冠幅、樹高、樹齡指標進行相關性分析可以看出，千年桐雌雄株的數量均與海拔呈正相關，而與樹齡無相關性。王志峰等[39]對青楊不同海拔雌雄株數比較發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的變化，雌雄群體會選擇最適合自身生長的環(huán)境進行繁殖，低海拔地區(qū)雌株占優(yōu)勢，雄株在高海拔地區(qū)占優(yōu)勢。與上述結論存在相悖性，可能是由于群體結構的年輕化，導致植株的數量屬于增長型；而對細枝柃的研究中也發(fā)現(xiàn)，在一個增長型種群內，株數會隨著齡級的增加而增加[40]。

3.3 千年桐雌雄株生理學差異

雌雄異株植物的雌雄個體對環(huán)境的反應各不相同，表現(xiàn)為生長、生物量、抗氧化防御酶活性等，其中碳水化合物是植物細胞中各種物質的碳架提供者，也是能量的攜帶者。本研究發(fā)現(xiàn)千年桐葉片中不同性別植株的養(yǎng)分含量均差異顯著（P＜0.05），且千年桐雌株的葉片中可溶性糖含量及淀粉含量均顯著高于雄株葉片的含量；千年桐不同性別植株的韌皮部養(yǎng)分中僅可溶性蛋白含量存在顯著差異（P＜0.05）。對黃連木的研究發(fā)現(xiàn)，雄株葉片積累的同化物較雌株葉片高，與本文研究結果相反[41]?？赡苡捎陴B(yǎng)分的“庫-源”關系，在生長期中雌株葉片養(yǎng)分需運輸給果實和根系兩個庫器官；而雄株葉片養(yǎng)分僅需運輸給根系一個庫器官，導致開花期前雌株積累的同化物較雄株高，以滿足植株的繁殖發(fā)育。

可溶性蛋白是植物原生質體內最豐富的有機物，是重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質。本研究表明千年桐植株葉片的可溶性蛋白含量雄株＞雌株，與王小燕等[41]對黃連木雌雄株間可溶性蛋白含量差異研究結論一致，但與強曉霞[42]對大麻（Cannabis sativa）葉片雌雄間可溶性蛋白含量差異研究結論相反。這表明多數雌雄異株植物在生理生化代謝過程中存在差異，雌雄株的代謝水平可能不同。

相關研究表明匍匐柳（Salix repens）和深山柳（Salix reinii）雌株POD活性高于雄株，雌株比雄株的防御能力強，但青柳（Rhipsalis cereuscula）雄株的SOP、POD的活性顯著高于雌株[43]。本研究中千年桐雌雄株的葉片各類酶的酶活性均為雌株＞雄株，但僅POD、CAT酶活性存在顯著差異（P＜0.05），與軟棗獼猴桃(Actinidia arguta）雌雄株葉片酶活研究結論一致[44]。強曉霞[42]研究則認為POD活性與雌性分化相關，CAT活性與雄性分化相關，從而葉片中CAT活性均在雄性植株中較高，POD活性則相反；與苦瓜（Momordica charantia）的研究結論一致[45]。對黃檗（Phellodendron amurense）的研究發(fā)現(xiàn)不同時間段雌雄株間酶活差異不同，在6-8月，雄株大于雌株；9月為雌株大于雄株[46]。說明雌雄株在不同的生長期內，其抗氧化防御能力、保護細胞免受氧化損失能力也不同。

雖然這些研究表明雌、雄株之間在生理生化方面存在一定的差異，但這些研究的對象仍然是成熟植株，而對于未成熟植株，仍然沒有一個明確區(qū)分雌、雄株的固定的方法，此方法也只能是在植物雌雄鑒定中作為一種輔助鑒別的證據。