婁永峰，宋曉琛，陳興彬，何 侃，肖復(fù)明★

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.吉安市青原區(qū)白云山林場(chǎng)，江西 吉安 343000)

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國(guó)最重要的鄉(xiāng)土針葉用材樹(shù)種之一，主要分布在長(zhǎng)江以南各省市。廣泛的種植區(qū)域和悠久的栽培歷史，促使杉木形成了一些優(yōu)良的變異類(lèi)型，例如紅心杉、羅田垂枝杉等。其中紅心杉材質(zhì)堅(jiān)硬、色澤獨(dú)特，深受人們青睞。陳山紅心杉是紅心杉的典型代表，是江西地方特色杉木優(yōu)良種源，原產(chǎn)于江西省安?？h陳山林區(qū)，因其心材紅褐色且心材比例大而得名[1]。江西省林業(yè)科學(xué)院最早開(kāi)展紅心杉的遺傳改良工作，收集和保存大量的紅心杉種質(zhì)資源，建立國(guó)家良種基地。持續(xù)收集保存的種質(zhì)資源為紅心杉遺傳改良和創(chuàng)新利用提供了豐富的材料，然而龐大的種質(zhì)資源數(shù)量也給其鑒定和評(píng)價(jià)帶來(lái)了困難，這就需要一種便捷有效的種質(zhì)資源鑒定和評(píng)價(jià)方法[2-3]。20世紀(jì)80年代末，DNA分子標(biāo)記的興起和發(fā)展為種質(zhì)資源快速有效的鑒定評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)[4]。目前DNA分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于林木種質(zhì)資源鑒定、DNA指紋圖譜繪制、分子身份證構(gòu)建等研究，其中SSR標(biāo)記由于具有共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于楊樹(shù)（Populus L.）、薄殼山核桃（Carya illinoensis）、白蠟（Fraxinus sp.）、茶 樹(shù)（Camellia sinensis）、板 栗（Castanea mollissima）等[5-10]。

本研究選擇已開(kāi)發(fā)的19個(gè)SSR標(biāo)記，利用熒光標(biāo)記對(duì)51個(gè)陳山紅心杉種子園無(wú)性系進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，開(kāi)展陳山紅心杉的遺傳多樣性分析和分子身份證構(gòu)建，以期為今后杉木種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自江西省吉安市青原區(qū)白云山林場(chǎng)陳山紅心杉1代種子園，共計(jì)51個(gè)無(wú)性系，依次編號(hào)C01~C51。2021年5月采集健康的新葉，冰袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室，于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

利用本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法提取試驗(yàn)材料的DNA，在完成其質(zhì)量及濃度檢測(cè)后，定量至約20.0~50 ng·μL-1，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR-PCR分析

通過(guò)文獻(xiàn)檢索，從前期已發(fā)表的杉木SSR標(biāo)記中挑選40對(duì)標(biāo)記[11-12]，然后進(jìn)行初篩。最終確定19個(gè)SSR標(biāo)記用于后續(xù)分析。引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，且正向引物5′端用熒光基團(tuán)修飾。

SSR-PCR擴(kuò)增體系（20.0μL）：DNA模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2×Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增在ABI-2720上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Gene Marker 2.2.0分析毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果，得到基因型數(shù)據(jù)。利用Popgene 32軟件分析各SSR位點(diǎn)的等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、期望雜合度（He）和觀測(cè)雜合度（Ho），多態(tài)性信息含量（PIC）等。利用Ntsys-pc 2.20v軟件計(jì)算各無(wú)性系之間的遺傳相似性系數(shù)，并進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析。根據(jù)所選SSR引物擴(kuò)增帶型結(jié)果繪制分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用19個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)陳山紅心杉種子園遺傳多樣性進(jìn)行分析（表1、圖1）。由表1可知：19個(gè)SSR標(biāo)記共檢測(cè)到72個(gè)等位基因位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)72個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為100%。各標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)2~11，平均3.8；其中有效等位基因數(shù)1.04~3.12，平均1.88；各標(biāo)記的觀測(cè)雜合度0.039~0.745，平均0.416，期望雜合度0.039~0.687，平均0.413，其中有7個(gè)標(biāo)記的觀測(cè)雜合度低于期望雜合度，表現(xiàn)出純合子過(guò)剩，雜合子不足。多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.038~0.657，平均0.363，在0.5≥PIC≥0.25之間，為中度多態(tài)性，且19個(gè)SSR標(biāo)記中低度和中度多態(tài)性位點(diǎn)居多，分別為5個(gè)和11個(gè)。

表1 陳山紅心杉種子園無(wú)性系19個(gè)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果Tab.1 Amplification results of 19 SSR markers for clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

圖1 標(biāo)記H007在陳山紅心杉種子園無(wú)性系部分樣本中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results for some clones of Red-heart Chinese fir seed orchard using H007 makers

2.2 聚類(lèi)分析

根據(jù)19個(gè)SSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果，建立矩陣，利用Ntsys-pc軟件計(jì)算各無(wú)性系之間的遺傳相似性系數(shù)，并進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明：51個(gè)陳山紅心杉1代種子園無(wú)性系之間遺傳相似性系數(shù)在0.528~1.000之間，平均遺傳相似性系數(shù)0.728，這表明種子園無(wú)性系之間遺傳差異較小，親緣關(guān)系較近。

UPGMA聚類(lèi)結(jié)果表明（圖2）在遺傳相似性系數(shù)為0.70時(shí)，可將51個(gè)無(wú)性系可分為6個(gè)亞組（Ⅰ~Ⅵ），且各亞組內(nèi)無(wú)性系數(shù)量差異明顯。其中，Ⅲ亞組內(nèi)無(wú)性系數(shù)量最多，包括C07、C18和C22等25個(gè)無(wú)性系，占49.2%；其次是Ⅰ亞組，包括C01、C29和C41等14個(gè)無(wú)性系，占27.5%；其余各亞組內(nèi)無(wú)性系數(shù)量均較少，Ⅳ亞組和Ⅵ亞組分別為4個(gè)無(wú)性系（C06、C21、C36和C48為Ⅳ亞組，C12、C19、C25和C45為Ⅵ亞組），Ⅱ亞組3個(gè)無(wú)性系：C04、C05和C51，而Ⅴ亞組只有1個(gè)無(wú)性系：C27。

圖2 51個(gè)陳山紅心杉種子園無(wú)性系聚類(lèi)分析Fig.2 Cluster analysis of 51 clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

另外，根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果可知：C03、C28和C30，C18和C22，C31和C37，C38和C39，C23和C35，C09和C20，C25和C45這些無(wú)性系之間的遺傳相似性系數(shù)相同，均為1，疑似為同一無(wú)性系材料。

2.3 基于SSR標(biāo)記的分子身份證構(gòu)建

依據(jù)SSR標(biāo)記的PIC值的高低，依次增加引物數(shù)量對(duì)種子園無(wú)性系進(jìn)行區(qū)分，結(jié)合UPGMA聚類(lèi)結(jié)果，最終選擇CLSSR09+H097+H076+CLSSR37+H007+CLSSR20+CLSSR38+CLSSR33等8個(gè)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增帶型結(jié)果構(gòu)建陳山紅心杉種子園無(wú)性系的分子身份證。首先根據(jù)每個(gè)SSR標(biāo)記擴(kuò)增帶型，由小到大的順序排列依次編號(hào)0~9，若超過(guò)9則編號(hào)A~Z，生成擴(kuò)增帶型編號(hào)（表2），然后將每個(gè)SSR標(biāo)記在各樣本中所擴(kuò)增帶型的編號(hào)進(jìn)行串聯(lián)排列，形成相應(yīng)的分子身份證編碼，同時(shí)對(duì)每個(gè)無(wú)性系的分子身份證進(jìn)行QR編碼。如表3所示，8位數(shù)字或字母分別代表8個(gè)SSR標(biāo)記在樣本中擴(kuò)增帶型，8位數(shù)字或字 母 從 左 到 右 依 次 代 表CLSSR09、H097、H076、CLSSR37、H007、CLSSR20、CLSSR38和CLSSR33標(biāo)記。以C01為例，可知其分子身份證編碼是38312431，即表示C1樣本在8個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果依次為CLSSR09（208/208）、H097（176/179），H076（267/273）、CLSSR037（174/177）、H007（253/259）、CLSSR20（161/161）、CLSSR38（163/172）和CLSSR33（124/163）。

表2 8對(duì)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增帶型編號(hào)Tab.2 The code of 8 pairs of SSR makers

表3 51個(gè)陳山紅心杉種子園無(wú)性系的SSR分子身份證Tab.3 Molecular identity code of 51 clones of Red-heart Chinese fir seed orchard

在供試的51個(gè)陳山紅心杉種子園無(wú)性系中，得到了43個(gè)不同的分子身份證編碼，其中，C03、C28和C30三者共享同一分子身份證編碼，而C18、C31、C38、C23、C09和C25各 自 分 別 與C22、C37、C39、C35、C20和C45共用一個(gè)分子身份證編碼?？梢?jiàn)，分子身份證代碼分析結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果相符，共用同一分子身份證代碼的無(wú)性系在聚類(lèi)分析中遺傳相似系數(shù)相同。

3 結(jié)論與討論

陳山紅心杉是江西地方特色杉木優(yōu)良種源，對(duì)其種子園的遺傳多樣性研究，有利于其種質(zhì)資源的保存和利用。本研究中，19個(gè)SSR標(biāo)記在51個(gè)陳山紅心杉無(wú)性系中共檢測(cè)到72個(gè)等位基因位點(diǎn)，平均等位基因數(shù)為3.8，平均有效等位基因數(shù)為1.88，平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.416和0.413，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.038~0.657，平均0.363。這表明陳山紅心杉種子園無(wú)性系中存在一定程度的雜合子缺失，遺傳背景較狹窄，遺傳多樣性處于中等水平，但具有一定的選育空間。相比方月等[13]對(duì)四川洪雅縣國(guó)有林場(chǎng)國(guó)家杉木良種基地杉木2代種子園的結(jié)果，陳山紅心杉種子園平均等位基因數(shù)（3.8vs10.1）、平均有效等位基因（1.88vs4.71）、平均觀測(cè)雜合度和期望雜合度（0.416vs0.440，0.413vs0.478）、平均多態(tài)性信息含量（0.363vs0.459）都略低。這可能是由于本研究的陳山紅心杉種子園為地方特色杉木種子園，其建園無(wú)性系來(lái)源于江西安?？h陳山林區(qū)的優(yōu)樹(shù)選擇，建園無(wú)性系選擇來(lái)源單一，選擇范圍狹小。

本研究聚類(lèi)分析結(jié)果表明51個(gè)陳山紅心杉種子園無(wú)性系之間的遺傳相似度較高（0.528~1.000），部分無(wú)性系具有相同的遺傳相似系數(shù)，這也進(jìn)一步說(shuō)明陳山紅心杉種子園無(wú)性系的遺傳多樣性處于中等水平，同時(shí)可以考慮在今后陳山紅心杉種子園營(yíng)建、新種質(zhì)創(chuàng)制等過(guò)程中適當(dāng)引入其它紅心杉種質(zhì)資源，增加遺傳多樣性。

分子身份證是在DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過(guò)不同的編碼方式對(duì)指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理后得到字符串形式的結(jié)果，更便于種質(zhì)資源的鑒別與檢索[14]。目前SSR標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物、果樹(shù)、花卉、林木等物種的DNA指紋圖譜或分子身份證構(gòu)建[5,15-18]。對(duì)于分子身份證的構(gòu)建，不同研究采用的編碼方法不一樣[19]。本研究采用數(shù)字與字母相結(jié)合的方式，通過(guò)將SSR標(biāo)記擴(kuò)增的帶型按照由小到大的順序排列并進(jìn)行編碼，得到各無(wú)性系的分子身份證代碼。本研究選取的8個(gè)SSR標(biāo)記平均多態(tài)性信息含量為0.478，具有良好的多態(tài)性，其中多態(tài)性信息含量高于平均值的有5個(gè)，理論上能夠區(qū)分500多個(gè)陳山紅心杉無(wú)性系種質(zhì)資源。本研究選取的51份陳山紅心杉種質(zhì)均得到了合理的區(qū)分，得到的分子身份證信息可用于今后種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)和利用。