魯銳 瞿云昆 楊卿 何琰澤 梁爽

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，主要特征是關(guān)節(jié)軟骨退變、關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨骨質(zhì)增生硬化和滑膜炎，臨床表現(xiàn)為慢性疼痛和功能障礙［1］。關(guān)節(jié)軟骨由細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞外基質(zhì)的維持依賴(lài)于軟骨細(xì)胞合成代謝和分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡［2］。蛋白聚糖（ACAN）和二型膠原（COL2A1）是軟骨細(xì)胞合成代謝中兩個(gè)至關(guān)重要的蛋白，合成代謝的減弱預(yù)示著軟骨的降解，因此增強(qiáng)軟骨細(xì)胞合成代謝有利于細(xì)胞外基質(zhì)的維持。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）、Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS5）是軟骨細(xì)胞分解代謝的指標(biāo)，其表達(dá)量的增加會(huì)加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，引起軟骨退變［3］。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制還未完全明了，研究認(rèn)為，骨關(guān)節(jié)炎與炎癥反應(yīng)、凋亡等因素密切相關(guān)，這些因素能介導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝的失衡，進(jìn)而引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解和破壞，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展［4］。抗炎反應(yīng)和促炎反應(yīng)的失衡可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的失衡，促炎因子能抑制軟骨細(xì)胞的合成代謝，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的分解代謝［5］。在骨關(guān)節(jié)炎的眾多炎癥因子中，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）被認(rèn)為是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展最重要的促炎因子之一［6］。因此，在骨關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究中，IL-1β造就的軟骨細(xì)胞炎癥模型被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎領(lǐng)域成熟的體外模型，且降低軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)水平被認(rèn)為有利于延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶2（COX-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等促炎因子也在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用［7］。此外，關(guān)節(jié)軟骨的退變除了與細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)之外，還與軟骨細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［8］。細(xì)胞生理狀態(tài)的穩(wěn)定有賴(lài)于促凋亡和抗凋亡的平衡，抗凋亡蛋白［B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）］和促凋亡蛋白［Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）］的失衡同樣是引起軟骨退變的機(jī)制之一。

酸漿苦味A（Physalina，PA）是從燈籠果中提取的化合物（C28H30O10），研究發(fā)現(xiàn)其具備抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗真菌等作用［4，9］，在不同的病理生理?xiàng)l件下能介導(dǎo)多種信號(hào)通路，比如核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）［10］、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）［11］、核因子-κB（NF-κB）［12］等信號(hào)通路。雖然抗炎鎮(zhèn)痛藥的使用是目前治療骨關(guān)節(jié)炎疾病中主要的治療措施，但其所引發(fā)的心血管和胃腸道風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。尋找替代的、副作用小的藥物成為一種趨勢(shì)。在骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究中，天然化合物逐漸走入學(xué)者的視野。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PA能通過(guò)抑制MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用［13］，本研究旨在進(jìn)一步研究PA 在凋亡途徑對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

酸漿苦味A（CAS No.23027-91-0）購(gòu)自中國(guó)ChemFaces。培養(yǎng)基為HyClone DMEM/F12 培養(yǎng)基（HyClone，美國(guó)），血清為Bioind胎牛血清（BioInd，澳大利亞），胰蛋白酶-EDTA（Gibco，美國(guó)），Ⅱ型膠原酶（索萊寶公司，中國(guó)）。小鼠源IL-1β購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8 kit），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、ADAMTS5抗體（貨號(hào)：A02802-1）、山羊抗兔和抗鼠二抗均購(gòu)自武漢博士德公司；GAPDH 抗體（貨號(hào)：60004-1-Ig），MMP13（貨號(hào)：18165-1-AP），ACAN（貨號(hào)：13880-1-AP），COL2A1 抗體（貨號(hào)：28459-1-AP）均購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；iNOS抗體（貨號(hào)：13120）、COX-2抗體（貨號(hào)：12282）、IL-6（貨號(hào)：12912）、Bax 抗體（貨號(hào)：2772）、Bcl-2 抗體（貨號(hào)：3498）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。酶標(biāo)儀、蛋白印跡電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

二、小鼠軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

5 日齡的C57BL/6 乳鼠購(gòu)自武漢鼠來(lái)寶生物科技有限公司。將乳鼠處死后放于75%的酒精中浸泡消毒后，在生物安全柜中使用顯微鑷取出乳鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨顆粒，注意清除掉軟骨顆粒周?chē)年P(guān)節(jié)囊、滑膜組織和肌腱。將軟骨顆粒剪碎并移至無(wú)菌的含0.25%的胰蛋白酶-EDTA EP 管中，在含5% CO2的37 ℃細(xì)胞敷育箱中敷育30 min。隨后1 500 r/min離心5 min，去掉胰蛋白酶，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，在37 ℃的雜交爐中繼續(xù)消化6～8 h。隨后1 500 r/min離心5 min，去掉Ⅱ型膠原酶，將軟骨細(xì)胞重懸混勻后種在T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%Bioind 胎牛血清的HyClone DMEM/F12 培養(yǎng)基。原代軟骨細(xì)胞被用于隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物操作均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

三、細(xì)胞活力檢測(cè)

將軟骨細(xì)胞種于96 孔板中（5 000～10 000 個(gè)細(xì)胞/孔），24 h 后細(xì)胞貼壁，用不同濃度的PA（0、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）、IL-1β（5 ng/mL）、不同濃度的PA（0，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）聯(lián)合IL-1β（5 ng/mL）分別干預(yù)軟骨細(xì)胞24 h。隨后，去掉舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，在37 ℃下避光敷育1～4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度。

四、軟骨細(xì)胞總蛋白提取

將原代軟骨細(xì)胞種在6 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁且細(xì)胞融合率達(dá)到70%時(shí)，使用IL-1β（5 ng/mL）單獨(dú)或聯(lián)合不同濃度的PA（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，具體分組為對(duì)照組、IL-1β組、IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組。待軟骨細(xì)胞干預(yù)24 h后，進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取。細(xì)胞總蛋白提取步驟如下：冰上操作，去掉6孔板中的培養(yǎng)基，PBS漂洗3次并濾紙吸凈殘留液體后，每孔中加入100 μL細(xì)胞裂解液（由RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑按100∶1∶1的比例配制所得），冰上裂解15 min后蛋白刮刮下細(xì)胞及裂解液混合物并收集至1.5 mL EP管中。經(jīng)超聲裂解后，14 000 r/min離心20 min，將上清計(jì)量并收集到新的1.5 mL EP管中，測(cè)量蛋白濃度后，加入蛋白上樣緩沖液，混勻后置于100 ℃金屬浴中變性5 min，隨后蛋白樣品放置于-20 ℃中保存。

五、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測(cè)ACAN、COL2A1、MMP13、ADAMTS5、iNOS、COX-2、IL-6、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)。將等質(zhì)量等體積的蛋白樣品按組別加入到上樣孔中，恒壓80 V 在濃縮膠中電轉(zhuǎn)30 min 后，改為恒壓120 V 繼續(xù)電轉(zhuǎn)至所需目的蛋白所在區(qū)間顯現(xiàn)。隨后采用濕轉(zhuǎn)法在275 mA 的恒流作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將聚偏氟乙烯（PVDF）膜放置于5%的脫脂牛奶中封閉1 h。隨后裁切條帶敷一抗，在4 ℃條件下敷育過(guò)夜。TBST 洗膜，10 min/次×3 次；隨后在室溫條件下敷育二抗1 h，繼續(xù)TBST 洗膜，10 min/次×3 次。最后均勻涂抹ECL 顯色發(fā)光液于PVDF 條帶上，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白曝光成像分析。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均來(lái)自于三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用one-way ANOVA 對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PA不影響軟骨細(xì)胞的活力

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)給予不同濃度的PA（0、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）或聯(lián)合IL-1β（5 ng/mL）干預(yù)24 h 后，軟骨細(xì)胞的活力沒(méi)有受到明顯的影響，表明實(shí)驗(yàn)濃度下的PA 和IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性（P＞0.05，圖1）。因此，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的PA和5 ng/mL的IL-1β被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 PA和IL-1β對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞活力的影響 a：?jiǎn)为?dú)給予不同濃度的PA對(duì)軟骨細(xì)胞活力無(wú)明顯改變（P＞0.05）；b：不同濃度的PA聯(lián)合IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞活力無(wú)明顯改變（P＞0.05）

二、PA 上調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞合成代謝標(biāo)志蛋白的表達(dá)

如圖2 所示，相比于對(duì)照組，IL-1β組能夠抑制軟骨細(xì)胞合成代謝關(guān)鍵蛋白ACAN 和COL2A1的表達(dá)（P＜0.05）；相比于IL-1β組，IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中合成代謝的關(guān)鍵蛋白（ACAN、COL2A1）表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性。這表明IL-1β能抑制軟骨細(xì)胞的合成代謝，而不同濃度的PA（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）能逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞合成代謝的抑制效應(yīng)。

圖2 PA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞合成代謝的影響 a：Western blot結(jié)果；b、c：蛋白灰度值定量分析柱狀圖。與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與IL-1β組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

三、PA 下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分解代謝標(biāo)志蛋白的表達(dá)

Western 蛋白印跡結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，IL-1β能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的分解代謝水平，即上調(diào)軟骨分解代謝標(biāo)志蛋白（MMP13和ADAMTS5）的表達(dá)（P＜0.05）。相比于IL-1β組，IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中分解代謝的關(guān)鍵蛋白MMP13和ADAMTS5的表達(dá)水平出現(xiàn)了下調(diào)（P＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。這表明IL-1β能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的分解代謝，而不同濃度的PA（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）能逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝的增強(qiáng)效應(yīng)（圖3）。

圖3 PA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分解代謝的影響 a：Western blot結(jié)果；b、c：蛋白灰度值定量分析柱狀圖。與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與IL-1β組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

四、PA抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)

如圖4，與對(duì)照組比較，IL-1β組中的炎性蛋白（iNOS、COX-2、IL-6）的表達(dá)水平在IL-1β刺激后升高（P＜0.05）；相比于IL-1β組，iNOS、COX-2、IL-6等炎性蛋白的表達(dá)水平在IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并呈濃度依賴(lài)性（P＜0.05），表明PA在軟骨細(xì)胞中能抑制IL-1β引起的炎性反應(yīng)。這說(shuō)明IL-1β能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而不同濃度的PA（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）能抑制IL-1β導(dǎo)致的炎癥增強(qiáng)效應(yīng)。

圖4 PA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 a：Western blot結(jié)果；b～d：蛋白灰度值定量分析柱狀圖。與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與IL-1β組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

五、PA抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡

相比于對(duì)照組，在IL-1β組中可見(jiàn)IL-1β抑制了Bcl-2 蛋白的表達(dá)。而相比于IL-1β組，IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定程度的回升；對(duì)于Bax蛋白，相比于對(duì)照組，在IL-1β組中可見(jiàn)IL-1β能引起B(yǎng)ax蛋白的表達(dá)上調(diào)，而相比于IL-1β組，IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中的Bax蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（圖5 a）。但綜合分析顯示，相比于對(duì)照組，Bcl-2/Bax的比值在IL-1β組下降，表明IL-1β能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡發(fā)生（P＜0.05）；而相比于IL-1β組，Bcl-2/Bax 的比值在IL-1β+PA（2.5 μmol/L）組、IL-1β+PA（5 μmol/L）組、IL-1β+PA（10 μmol/L）組中上升，表明2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 的PA能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡（P＜0.05），表明PA具有抗凋亡作用（圖5 b）。

圖5 PA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡水平的影響 a：Western blot結(jié)果；b：蛋白灰度值定量分析柱狀圖。與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與IL-1β組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

討 論

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨損害為主要病理改變的慢性退行性疾病，多見(jiàn)于老年人，以疼痛和功能障礙為主要癥狀。該疾病病程長(zhǎng)且多為進(jìn)行性加重，治療周期長(zhǎng)，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［14］。

一、軟骨細(xì)胞合成代謝和分解代謝在關(guān)節(jié)軟骨中的作用

在軟骨的合成代謝酶中，ACAN和COL2A1是主要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［15］。ACAN是軟骨細(xì)胞合成代謝標(biāo)志物，是軟骨中的主要蛋白聚糖，具有承重和抗壓縮特性，這對(duì)于維持軟骨的生理特性至關(guān)重要。COL2A1 是另一個(gè)軟骨合成代謝的關(guān)鍵指標(biāo)，關(guān)節(jié)軟骨的抗拉伸特性得益于COL2A1 的特殊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，膠原酶介導(dǎo)的膠原蛋白降解導(dǎo)致早期骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［16］。在軟骨細(xì)胞的分解代謝中，分解代謝酶如MMPs（MMP1、MMP3、MMP13）和ADAMTS（ADAMTS4、ADAMTS5）在軟骨降解中起關(guān)鍵作用，其中MMP13是軟骨細(xì)胞分解代謝中最重要的分解酶，它可以靶向降解膠原蛋白，并優(yōu)先降解ACAN 和COL2A1［17-18］。臨床研究證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎病人中MMP13 的表達(dá)升高，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，MMP13 缺陷小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的表型異常，而過(guò)表達(dá)MMP13的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)軟骨破壞，并伴有ACAN和COL2A1的減少，提示MMP13升高可能是軟骨退變的原因［19］。此外，ADAMTS5 是ADAMTS 家族中可以降解ACAN 的重要成員之一，其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中顯著上調(diào)，單敲ADAMTS5 基因可減輕軟骨退化［20］。

二、炎癥反應(yīng)失衡通過(guò)降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解被認(rèn)為是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，而炎癥反應(yīng)是引起細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要機(jī)制［21］?？寡追磻?yīng)和促炎反應(yīng)的失衡能引起軟骨細(xì)胞合成代謝和分解代謝的紊亂，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解［22］。促炎反應(yīng)能抑制合成代謝關(guān)節(jié)蛋白的表達(dá)，并能引起軟骨細(xì)胞分解代謝的增強(qiáng)，而抗炎反應(yīng)則能起到相反的作用。在IL-1β刺激下，軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，而促炎因子的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)引起基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、其他細(xì)胞因子和前列腺素的生成增多，進(jìn)而導(dǎo)致ACAN 和COL2A1 的合成減少，加速了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，引起關(guān)節(jié)軟骨的退變［23］。因此，抑制IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的有效治療策略［24］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)IL-1β抑制了軟骨細(xì)胞的合成代謝（ACAN 和COL2A1 表達(dá)下調(diào)），增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的分解代謝（MMP13 和ADAMTS5 表達(dá)上調(diào)），且增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)（iNOS、COX-2、IL-6 表達(dá)上調(diào)），而PA 能逆轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)上述指標(biāo)的影響，表明PA 能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的合成代謝、抑制分解代謝，且具備抗炎效應(yīng)。

三、軟骨細(xì)胞凋亡促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞類(lèi)型，其存活狀態(tài)和生理功能直接關(guān)系到關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)［25］。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞死亡可與細(xì)胞外基質(zhì)丟失形成惡性循環(huán)，而細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過(guò)程，與癌癥、發(fā)育異常和退行性疾?。ㄈ绻顷P(guān)節(jié)炎）密切相關(guān)［26］。促凋亡和抗凋亡的失衡同樣是介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退變的重要機(jī)制［26］。Bcl-2 蛋白家族是一個(gè)特殊的蛋白家族，由抗凋亡成員（如Bcl-2、Bcl-x）和促凋亡成員（如Bax、Bad、Bid）組成［27］。在抗凋亡成員中，Bcl-2 是一個(gè)關(guān)鍵的抗凋亡基因，能夠阻止細(xì)胞色素c 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制了細(xì)胞凋亡［28］；在促凋亡基因中，Bax基因是非常重要的促細(xì)胞凋亡的基因之一，其編碼的Bax蛋白與Bcl-2形成二聚體，能抑制Bcl-2抗凋亡作用的發(fā)揮［27-28］。研究認(rèn)為，Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量比值的高低可反映細(xì)胞發(fā)生凋亡的強(qiáng)弱［29］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，單純使用IL-1β抑制了Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加了Bax 蛋白的表達(dá)水平。而在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 的PA 能上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)并抑制Bax 蛋白的表達(dá)；Bcl-2/Bax的比值表明IL-1β能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，而PA能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

此外，我們的前期小鼠體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PA通過(guò)整合素αVβ3 抑制MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)膝關(guān)節(jié)腔注射PA能緩解膝關(guān)節(jié)軟骨的磨損和退變［13］。因此，我們認(rèn)為，PA 增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的合成代謝、抑制分解代謝，且具備抗炎和抗凋亡效應(yīng)，表明了PA 具備保護(hù)軟骨細(xì)胞的特性，有望成為骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療藥物。