常相娜， 陳雪峰， 蘇 瑤

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

我國是蘋果生產(chǎn)大國，蘋果汁出口量巨大[1]，每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸蘋果汁加工副產(chǎn)品--蘋果渣(Apple pomace，AP)[2].盡管AP富含黃酮、多酚、多糖等活性成分[3]，但局限于利用方法有限，大多數(shù)AP依然作為廢物丟棄，未得到充分有效利用，造成資源浪費與環(huán)境污染[4].因此，探討高附加值利用AP及其活性成分有著顯著的社會價值和潛在的經(jīng)濟效益.多糖在植物中廣泛的存在，發(fā)揮支撐組織或儲存營養(yǎng)的功能.近年來，由于植物多糖具有多種生物活性，如抗氧化[5,6]、抗炎[7,8]、抗癌[9]及免疫調(diào)節(jié)[9]等作用，且具有安全無毒的特性[10]，故受到越來越多的關(guān)注，已逐步開發(fā)應(yīng)用在醫(yī)藥、保健食品等行業(yè).正因如此，作為AP中主要活性成分之一的蘋果渣多糖(Polysaccharide from apple pomace，PAP)受到了研究人員的關(guān)注.Sun等[11]先將AP預(yù)壓處理后，分離獲得的PAP進行研究，表明PAP具有良好的抗氧化活性；Li等[12]研究證實PAP至少部分通過調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)和Wnt通路阻止了ICR小鼠發(fā)生結(jié)腸炎相關(guān)的大腸癌；Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)PAP可以成功地改善與肥胖相關(guān)的肝代謝紊亂；Wang等[14]研究表明PAP可顯著緩解與營養(yǎng)不良相關(guān)的腸道通透性和慢性炎癥.上述研究表明PAP具有抗氧化、抗腫瘤、改善肝功能及營養(yǎng)不良等多種生物活性.

酶解法提取多糖具有條件溫和、雜質(zhì)易于去除、產(chǎn)率高等優(yōu)點[15]，是提取果渣多糖的常用方法之一.已有研究表明不同的提取方法對多糖收率、結(jié)構(gòu)與活性都會產(chǎn)生影響[16,17]，而關(guān)于酶解蘋果渣中的多糖與非酶解蘋果渣多糖在結(jié)構(gòu)與活性上的差異尚未見相關(guān)報道.本文采用實驗室前期研究獲得的復(fù)合酶酶解蘋果渣優(yōu)化工藝，進行蘋果渣多糖提取，所得酶解蘋果渣多糖(Polysaccharides from enzymatic Apple Pomace，PEAP)對比非酶解處理PAP，分析理化特性及結(jié)構(gòu)變化、評價抗氧化活性，探討結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣(40目)，陜西省海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司；葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸，上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品購于西格瑪奧德里奇公司；氫氧化鈉(色譜純)、醋酸鈉(色譜純)購于于西格瑪奧德里奇公司；三氟乙酸(色譜純)、甲醇(色譜純)購于德國CNW科技公司；牛血清蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

ICS5000離子色譜，Thermo Fisher Scientific有限公司；ELEOS System凝膠色譜儀，Wyatt有限公司； VECTOR-22傅里葉紅外光譜分析儀，德國Bruker公司；SPI3800N原子力顯微鏡，日本精工儀器公司；FD-ID-50冷凍干燥器，上海比朗儀器制造有限公司；Varioskan flash多功能酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；CT15RT臺式冷凍離心機，青島科易儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解蘋果渣多糖的制備

工藝流程：蘋果渣→預(yù)處理→酶解→滅酶→過濾→濃縮→除蛋白→醇沉→抽濾→干燥→樣品

操作要點：將4倍體積的蒸餾水加入除雜粉碎后AP中，常溫下攪拌30 min，過濾后所得濾渣用溫水沖洗兩遍，60 ℃干燥后過40目篩.稱預(yù)處理后原料AP 10.0 g，按料液比1∶20(g/mL)加入pH值為5.1的緩沖鹽溶液，添加復(fù)合酶(纖維素酶20 U/g；果膠酶80 U/g)，置于44 ℃下，經(jīng)2 h溶脹后于轉(zhuǎn)速為100 r/min的恒溫振蕩水浴中5.5 h，然后樣品通過90 ℃水浴進行10 min滅酶.然后過濾取上清液，將其濃縮至原體積的1/2，經(jīng)反復(fù)凍融三次除蛋白后，緩緩加入4倍體積的95%乙醇，攪勻，4 ℃靜置24 h進行醇沉.離心得沉淀，用適量水溶解后透析48 h，后凍干得PEAP.同時設(shè)有不加酶、其他操作一致的對照實驗組，得PAP.收率由公式(1)計算：

(1)

1.3.2 總多糖含量和總蛋白含量測定

總多糖含量采用苯酚-硫酸法測定；總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定.

1.3.3 傅里葉-紅外(FT-IR)光譜分析

稱取多糖樣品1 mg，按1∶150的比例將多糖樣品與溴化鉀共研混勻后壓制成片，掃描波長在4 000 cm-1～400 cm-1區(qū)間范圍內(nèi)的紅外譜圖.

1.3.4 分子量測定

采用凝膠色譜分析多糖樣品的分子量分布.將PAP與PEAP制成1 mg/mL樣品，過0.22 μm水膜，待測.色譜條件如下：色譜柱：串聯(lián)Shodex-OHpak SB-806HQ和SB-803HQ(300×8 mm，6 μm)；流動相：200 mg/L NaN3水溶液；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：500 μL.

1.3.5 單糖組成分析

精確稱量多糖樣品5 mg(±0.05 mg)置于色譜瓶中，加入配置好的三氟乙酸溶液，121 ℃加熱2 h.通氮氣，吹干.加入甲醇清洗，再吹干，重復(fù)甲醇清洗2～3次.加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶待測.采用高效陰離子交換色譜分析PAP與PEAP的單糖組成.色譜條件如下：色譜柱為DionexTMCarboPacTMPA200 (Thermo Fisher Scientific)；檢測器：電化學(xué)檢測器/脈沖安培檢測器；流動相：A相為超純H2O、B相為100 mM NaOH、C相為100 mM NaOH/200 mM NaAC；流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL.

1.3.6 原子力顯微鏡(AFM)觀察

將待測樣品溶解在去離子水中配制成10 μg/mL溶液，并在室溫下輕輕攪拌4 h.將測試樣品滴在云母載體表面，室溫常壓下干燥.采用原子力顯微鏡儀器在常溫常壓下、標(biāo)準(zhǔn)氮化硅針尖接觸模式拍攝AFM圖像.

1.3.7 體外抗氧化活性

(1)羥基自由基(·OH)清除活性

采用改進的Fenton反應(yīng)評價PAP與PEAP的·OH清除率[18]，準(zhǔn)確吸取不同濃度樣品溶液1.0 mL、4.5 mmol/L FeSO4 1 mL、4.5 mmol/L 水楊酸-乙醇1 mL，混勻后加4.4 mmol/L H2O21 mL啟動Fenton反應(yīng)，以維生素C(vitamin C，Vc)為對照，37 ℃水浴30 min 后8 000 r/min 離心3 min，于510 nm下測定吸光度.·OH清除率由公式(2)計算：

(2)

式(2)中：As為樣品吸光值，As0為樣品本底吸光值，A0為空白對照吸光值.

(2)超氧陰離子(O2-·)清除能力

以Vc為對照，通過鄰苯三酚自氧化法測定O2-·清除能力.準(zhǔn)確吸取pH 7.3、0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液2.0 mL，0.1 mL不同濃度PAP與PEAP樣品(對照為0.1 mL蒸餾水)，上述溶液混勻，25 ℃水浴20 min，立即加入預(yù)熱的25 ℃ 60 mmol/L鄰苯三酚 0.1 mL(采用10 mmol/L HCl 配制，空白對照為10 mmol/L HCl)，快速搖勻，319 nm下每隔30 s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值，然后計算清除率.O2-·清除率由公式 (3)計算：

(3)

式(3)中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA為加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率.

(3)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)清除活性

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基化合物，在517 nm處具有最大吸收.它廣泛用于測定抗氧化劑清除自由基的能力.參照Zhao等[19]方法并加以改進.準(zhǔn)確吸取不同濃度PAP與PEAP樣品溶液1.0 mL，加入0.03 mg/mL DPPH 溶液4.5 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min后，在517 nm 下測定吸光值.以Vc為對照.DPPH·清除率由公式(4)計算：

(4)

式(4)中：As為樣品吸光值，As0為樣品本底吸光值，A0為空白對照吸光值.

(4)ABTS+·自由基清除能力

取配制ABTS+·工作液，使其在734 nm下測定的吸光值保持在0.7±0.02.取80 μL不同濃度的PAP與PEAP溶液和4 mL ABTS+·工作液，震蕩混勻，在30 ℃水浴中反應(yīng)15 min，在734 nm下測吸光值A(chǔ)s.以Vc為陽性對照[20].ABTS+清除率由公式(5)計算：

(5)

式(5)中：As為樣品吸光值，As0為樣品本底吸光值，A0為空白對照吸光值.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

樣品均平行測定3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.p<0.05為有顯著性差異，p<0.01為有極顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 蘋果渣多糖制備及含量分析

多糖的收率及含量組成結(jié)果如表1所示.PEAP的收率為16.17%，顯著高于PAP的收率(p<0.01).這是因為在復(fù)合酶中纖維素酶作用于細(xì)胞壁上的主要成分纖維素，使果渣結(jié)構(gòu)組織變得較疏松，親水性相對好些的果膠能夠更充分的與復(fù)合酶中果膠酶接觸并溶出，所以經(jīng)復(fù)合酶酶解后AP的多糖收率顯著提高.已有研究表明，復(fù)合酶處理后的刺梨果渣[15]和紅棗渣[21]中多糖的提取率同樣都有明顯提升.PEAP中總多糖含量為70.90%較PAP高4.47%，而兩者的總蛋白含量接近，PEAP為4.05%、PAP為3.90%，沒有顯著性差異.

表1 多糖收率及含量組成分析

2.2 FT-IR光譜分析

PAP與PEAP的紅外特征吸收光譜如圖1所示.PAP的光譜吸收帶與PEAP基本一致.這與單糖分析一致的結(jié)果吻合.紅外譜圖的差異主要體現(xiàn)在官能團的透射強度上，產(chǎn)生原因為不同單糖類型含量不同.最為典型的是在1 600 cm-1處的峰是酯羰基(COOR)和羧酸根離子拉伸振動帶(COO-)[22]，反應(yīng)的是多糖中的糖醛酸的含量，PEAP的透射率遠(yuǎn)高于PAP的透射率，說明PEAP中糖醛酸含量高于PAP中的糖醛酸含量.這點與單糖分析結(jié)果一致.PEAP與PAP紅外光譜峰的具體歸屬如下：在3 600～3 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的寬峰是O-H的拉伸振動，紅外光譜中約3 442.78 cm-1(PAP)和3 440.85 cm-1(PEAP)的譜帶強度是由于多糖的羥基伸縮振動所致，而且它們的譜帶范圍很寬[23].2 941.31 cm-1(PAP)和2 939.38 cm-1(PEAP)是由C-H拉伸振動引起的[24].1 600 cm-1處的峰是酯羰基(COOR)和羧酸根離子拉伸振動帶(COO-).波數(shù)范圍1 419～1 200 cm-1的峰是由C-H的彎曲振動引起的，1 150 cm-1、1 100 cm-1和1 020 cm-1的峰是半乳糖醛酸在多糖中的主要吸收區(qū)[25].PAP和PEAP分別在1143.74 cm-1、1 097.45 cm-1和1 020.3 cm-1和1 145.67 cm-1、1 101.3 cm-1和1 018.37 cm-1處出現(xiàn)強峰，表明PAP和PEAP富含醛酸.上述分析進一步證實PAP和PEAP是富含糖醛酸的酸性多糖，這與單糖數(shù)據(jù)一致.

圖1 PAP與PEAP的FT-IR圖譜

2.3 分子量分布

PAP與PEAP分子量分布如表2所示.PAP的主Mw大于50 kda，其中200≥Mw≥50 kDa占PAP的93.9%，而PEAP的主Mw處于50≥Mw≥4 kDa區(qū)間，占EAPP的92.1%.研究表明，PAP的分子量大于PEAP的分子量，這歸因于纖維素酶與果膠酶復(fù)合酶解的作用.現(xiàn)有研究表明多糖分子量與其生物活性密切相關(guān)[26].分子量過大，分子的體積也大，阻礙其進入生物體發(fā)揮活性，并且與分子量相關(guān)的特性黏度、溶解性及多糖分子的高級結(jié)構(gòu)的變化都可能影響多糖生物活性；但多糖分子過小時，則可能無法形成有活性的空間結(jié)構(gòu)造成活性降低甚至消失.本研究中PAP與PEAP的分子量有著明顯的變化，可預(yù)見兩者在活性方面表現(xiàn)會不盡相同.

表2 PAP與PEAP的分子量分布

2.4 單糖組成及含量

PAP與PEAP中單糖的保留時間與組成含量如表3所示.其中PEAP主體單糖組成類型與文獻報道一致[13]；但兩者在具體的單糖含量存在差異，推斷是提取方法不同帶來的[27]，如巖藻糖(PAP 3.61%，PEAP 0.71%)、鼠李糖(PAP 18.47%，PEAP 7.07%)；含量差異最大的為半乳糖醛酸，PEAP的半乳糖醛酸含量為43.50%，較PAP的含量高出20.01%，分析其原因可能與果膠酶降解果膠導(dǎo)致果膠中有更多的半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)暴露出來，最終提升了PEAP的半乳糖醛酸含量.現(xiàn)有研究證實單糖的類型或含量對多糖的活性產(chǎn)生影響[28]，特別是糖醛酸結(jié)構(gòu)，因其能改變多糖的性質(zhì)和溶解度，故一些富含糖醛酸的多糖表現(xiàn)出較高的活性.PAP與PEAP中糖醛酸含量的顯著差異決定有必要對兩者產(chǎn)生的活性進行比較研究.

表3 PAP與PEAP的單糖保留時間與組成

2.5 AFM觀察結(jié)果

PAP與PEAP的平面與立體AMF圖像如圖2所示.兩種果渣多糖AMF立體圖形貌都是凹凸不平、不均一，似山峰形狀的不規(guī)則的突起，對應(yīng)到平面圖像中則為球狀、不均一的團塊，表明PAP與PEAP分子具有分支結(jié)構(gòu)，在10 μg/mL濃度下，這些支鏈型結(jié)構(gòu)緊密地纏繞在一起形成聚集，從而形成圖象中的形貌[29,30].分子聚集可歸因于多糖側(cè)鏈上的羥基可以相互或與水分子形成強大的分子間和分子內(nèi)相互作用[31,32].對比PAP與PEAP的平面與立體AMF圖像，PEAP的圖像中有更多的團塊和不規(guī)則突起，說明PEAP較PAP具有更多的支鏈性結(jié)構(gòu).

圖2 PAP與PEAP的平面與立體原子力顯微鏡圖

2.6 體外抗氧化活性

PAP與PEAP對·OH 、O2-·、DPPH·與ABTS+·自由基清除活性結(jié)果如圖3所示.多糖對上述四類自由基的清除活性均呈現(xiàn)出濃度依賴性，均表現(xiàn)出與濃度變化正相關(guān).對比2.0 mg/mL濃度下，PAP與PEAP對不同類型自由基的清除率，·OH清除率(如圖3(a)所示)：PAP為22.78%，PEAP為33.98%，是前者的1.49倍；O2-·清除率(如圖3(b)所示)：PAP為23.07%，PEAP為34.16%，是前者的1.48倍；DPPH·清除率(如圖3(c)所示)：PAP為34.49%，PEAP為53.99%，是前者的1.57倍；ABTS+清除率(如圖3(d)所示)：PAP為23.35%，PEAP為30.68%，是前者的1.31倍.

圖3 PAP與PEAP體外抗氧化性活性比較

由此可知，總體上PEAP相較于PAP具有更強的體外抗氧化活性.已有研究表明，多糖中單糖類型及含量影響多糖的生物活性[28]，如醛酸含量被認(rèn)為與抗氧化活性相關(guān)[33].在本研究中，PAP的含量為22.99%，PEAP的半乳糖醛酸含量為43.50%，PEAP的半乳糖醛酸含量高出APP含量20.01%，PEAP相較于PAP具有更強的體外抗氧化活性，呈現(xiàn)出抗氧化活性與糖醛酸含量正相關(guān)，與Su等[34]的研究結(jié)果一致.同時，酶解作用使得PEAP比PAP分子量降低、支鏈結(jié)構(gòu)增多，故PEAP結(jié)構(gòu)中還原末端數(shù)量增多，且增加側(cè)鏈基團，也增加一定的親水基，有助于活性提高.因此，PEAP相較于PAP表現(xiàn)出更好的體外抗氧化活性，Qi等[35]與Liu等[36]也報道過同類的研究結(jié)果.

3 結(jié)論

本文探討了酶解處理對蘋果渣中多糖的影響，對比研究PEAP與PAP，分析二者的理化特性，對比酶解前后的結(jié)構(gòu)變化，評價其抗氧化活性，并探討了結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系.研究表明PAP與PEAP是酸性多糖，單糖組成類型一致，但具體的單糖組成含量存在差異，這其中，含量差異最大的為半乳糖醛酸，PEAP的半乳糖醛酸含量高出APP含量20.01%；PAP的分子量高于PEAP的分子量；APP與PEAP的紅外光譜吸收帶基本一致，這與單糖分析一致的結(jié)果吻合.通過評價APP與PEAP對·OH 、O2-·、DPPH·與ABTS+自由基清除活性，其結(jié)果表明PAP與PEAP的體外抗氧化活性均呈現(xiàn)出濃度依賴性，總體上PEAP相較于PAP具有更強的體外抗氧化活性，結(jié)合現(xiàn)有研究，推斷這可歸因于PAP與PEAP組成多糖的糖醛酸含量、分子量大小和分支結(jié)構(gòu)的差異，具體影響規(guī)律有待于進一步研究.本研究說明不同提取方法會影響蘋果渣中多糖的結(jié)構(gòu)與活性，為蘋果渣及其活性多糖成分的提取及深入開發(fā)利用提供了理論依據(jù).