王 斌，吳紅彥，曾慶濤，王雅樂，黃 海，宋婷婷

（廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，深圳 羅湖 518000）

熟地黃屬于玄參科植物類，性：甘、微溫；歸肝、腎經；功效：補血滋陰，益精填髓。現代研究揭示，熟地黃主要含有梓醇、地黃苷、地黃素、氨基酸等多種成分，可提高人體的免疫能力，具有抗氧化、提高機體記憶力、延緩機體衰老等作用，通過網絡藥理挖掘該藥潛在的藥用價值[1]。

阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一種神經性、退行性、不可逆轉性神經系統的疾病，主要以大腦皮質層慢性退化為主要病變，以記憶力衰退、情感障礙、抽象思維力等臨床特征為主。目前，美國已將AD納入無法預防、無法治愈的十大死亡病種之一[2]。據報道，全球約4 680萬AD患者，中國AD患者占比已超全球l/4，而我國老齡化人口每年在遞增，同時AD患者也在遞增[3]。但AD發(fā)病機理十分復雜，當前研究AD發(fā)病可能與β-淀粉樣蛋白沉積、過度磷酸化Tau蛋白有不可分割的聯系，包括神經炎癥、神經元死亡、特異性神經遞質減少和相關突觸的丟失等相關的病理過程有關聯[4]。目前治療該病的藥物主要以膽堿酯酶抑制劑為主[5]，如多奈哌齊、茴拉西坦、美金剛等，療效欠佳，不良反應頗多。鑒于這種情況，探尋高效低毒、長期服用，防治AD的新型藥物具有重大意義[6]。

網絡藥理學主要集中藥藥理學、計算機模擬技術、生物分子信息等為主的研究方法[7]，多層次、多途徑、全方位的揭示熟地黃治療AD的作用機制[8-10]。繪制藥物-靶點-AD的網絡分析圖，進行關聯性分析[11]；揭示了熟地黃治療AD的核心靶點、通路及作用機制，為更深層次的研究AD提供新的思路、新的方法[12]。

1 材料與方法

1.1 熟地黃活性成分及作用靶點的獲得和篩選

利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）計算機生物系統數據庫，以“熟地黃”為關鍵詞，檢索出所有活性成分，依據ADME參數，OB≥30、DL≥0.18為篩選指標[13]。在梳理相關文獻的基礎上[14]，篩選出主要有效活性成分。將藥物主要成分上傳到UniProt中找對應名稱，對名稱進行矯正[15]。

1.2 網絡構建圖

以“AD”為檢索詞，英文名為“Alzheimer Disease”；從OMIM、GeneCards庫中檢索AD的靶點基因，將兩庫篩選的靶點全部合并，剔除重復靶點735個，取得AD靶點。利用R軟件，將藥物主要活性成分和AD靶點取交集，獲取熟地黃治療AD的靶點，繪制呈韋恩圖。

1.3 網絡圖構建與分析

將熟地黃的主要活性成分和AD靶點取交集，獲取靶點即為熟地黃治療AD的關鍵基因靶點。下載Cytoscape 3.7.1軟件，安裝JAVA軟件，將藥物、靶點和疾病的文本導入軟件中，繪制“藥物-靶點-疾病”網絡圖。節(jié)點（Node）代表藥物靶點，邊（Edge）代表成分、靶點、疾病之間的連接。整個網絡構建圖呈現藥物-成分-靶點-疾病之間的關聯，通過網絡圖可以深入探究熟地黃治療AD的作用機制。

1.4 構建PPI（Protein-ProteinInteraction）

將藥物和疾病的靶點文本，導入STRING中，將篩選條件設置為“Multiple Proteins”，物種篩選設置為“Homo Sapiens”，設置最低閾值，設為“medium confidence”，將離散游離的靶點隱藏，其他參數設置為默認值，用txt將文件保存。上傳至Cytoscape 3.7.1 軟件，設置相關參數使連接節(jié)點的大小和顏色深淺反映度值大小，邊的粗、細反映結合率分值的高低，構建PPI圖。

1.5 GO注釋及KEGG通路分析

運用Bioconductor生物包，安裝R軟件之后安裝生物包，分析GO注釋信息，KEGG通路分析。通過以上軟件，將篩選條件設置為P＜0.05，進行通路分析，同時將通路分析結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 藥物活性成分篩選

通過TCMSP篩選到藥物有效活性成分共78個，以OB≥30和DL≥0.18為篩選條件，篩選出活性成分2個，見表1。

表1 熟地黃活性成分表

2.2 熟地黃治療AD的靶點預測

從TCMSP中篩選到藥物活性成分共78個，主要活性成分2個。運用GeneCards、OMIM基因庫中獲取AD靶點，并合并刪去735個重復靶點。運用R軟件，安裝相應的“VennDiagram”程序包，獲取交集靶點，同時繪制韋恩圖（圖1），得到共同靶點10個，揭示了熟地黃可通過多個靶點治療AD。

圖1 藥物治療AD靶點交集圖

2.3 網絡圖的構建

將藥物與基因靶點上傳至Cytoscape3.7.1中，繪制網絡作用圖。整個網絡構建圖呈現藥物-成分-靶點-疾病之間的關聯，通過網絡圖可以深入探究熟地黃治療AD的作用機制。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖

2.4 熟地黃治療AD形成的關鍵靶點

將藥物與疾病的靶點上傳至STRING，輸入藥物治療AD形成的靶點，將篩選條件設置＞0.9，將游離蛋白予以隱藏，繪制熟地黃對應的靶點PPI網絡（見圖3），邊表示靶點作用關系；邊數越多，表示該節(jié)點對應的靶點在網絡中的作用越重要。揭示了CHRM1、ADRA1A、CHRM3、PGR、CHRM2、GABRA1等蛋白度值高，表明上述蛋白在疾病中的作用顯著，這些蛋白將成為聯系其他蛋白的紐帶。

圖3 關鍵靶點PPI網絡

2.5 GO生物功能及KEGG通路分析

在R軟件中安裝Bioconductor生物包，整合GO、KEGG數據庫進行通路富集分析。GO注釋揭示了核心靶點與G蛋白偶聯胺、乙酰膽堿、神經遞質、G蛋白偶聯5-羥色胺、血清素、G蛋白偶聯神經遞質等受體活性有關聯，闡釋了熟地黃可通過調控的生物細胞分子、基因、抑制轉錄進程來治療AD（圖4）。通過KEGG通路富集分析，獲取6個通路圖，通過設置篩選條件為q-value＜0.05，p-value＜0.05，KEGG通路分析，獲取1條主要信號通路，結果見表2。富集分析圖顯示，主要集中在鈣離子（4個基因）等信號通路上（圖5）。

圖5 熟地黃對AD作用靶點在鈣信號通路中的作用位置

表2 KEGG 代謝通路

圖4 關鍵靶點基因生物功能注釋信息

3 討論

AD是癡呆病中常見病、多發(fā)病之一，是神經系統疾病中仍亟須解決的熱點問題之一。隨著全球老齡化人口逐年的遞增，AD患者也在同步遞增，給老齡人的生活質量和生命周期構成了極其嚴重的威脅，相應地也給全球的醫(yī)療資源帶來了極其嚴重的負擔。經統計發(fā)現在治療AD的方劑中熟地黃出現的頻次較多[16]。熟地黃性甘，微溫。歸肝、腎經。具有補血滋陰，益精填髓之功。該藥可降低Aβ神經毒性起到保護神經的作用[17]。大劑量熟地黃（雌激素）可以抑制Aβ誘導的神經元凋亡細胞。因此，我們認為熟地黃可代替雌激素作為另一種方法抑制Aβ的神經毒性作用[18]。

1987年生理學家Kha-chaturian[19]最早提出鈣失調的有關假說，但最初未引起科學家們的關注。近些年，科學家們提供了充分的證據證明AD早期的病理改變與機體神經細胞內Ca2+紊亂有關聯，該假說于2017年被正式提出并對現階段的諸多疑問做了簡單的概述[20]。而AD的Ca2+假說也不是單獨存在，與其他假說有一定關系，鈣信號通路的傳導異常可破壞β-淀粉樣蛋白（Aβ）的毒性、PS神經毒性作用和細胞器功能紊亂等。鈣離子紊亂與鈣信號通路表達異常在AD的發(fā)生、發(fā)展及演變過程中起重要作用[21]。Aβ是經γ分泌酶剪切而成的。PS成為了γ分泌酶的催化中心，因此，FAD的變異影響到γ分泌酶的相關功能[22]。但是，可以通過調節(jié)γ分泌酶的相關活性從而影響Notch的產生，可為治療AD提供新的思路[23]。有研究表明參與腎虛AD的相關差異基因的表達主要集中在Ca2+信號通路以及細胞黏附分子等信號通路上，差異基因的相關表達主要集中在Ca2+信號通路上，揭示了Ca2+信號通路表達異?？赡苁悄I虛AD潛在的致病機制。

綜上所述，本次通過網絡藥理研究，揭示了熟地黃治療AD是通過“多靶點、多成分、多通路”的調控發(fā)揮治療作用[24]，其作用機制可能與調節(jié)鈣信號通路有關，其機制可與核心靶點G蛋白偶聯胺、乙酰膽堿、神經遞質等受體活性相關。這為科研實驗療效評價指標的篩選提供理論依據[25]。