劉曙光，楊彥寧，隆雪明，陳福華，匡光偉，周 燦，歐海軍

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

隨著河北某縣“又見瘦肉精”事件的曝光，“瘦肉精”一詞再次出現(xiàn)在大家視野中。瘦肉精一般泛指具有相似結(jié)構(gòu)的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑（簡(jiǎn)稱β-激動(dòng)劑），能夠抑制動(dòng)物脂肪生成，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，特別對(duì)提高畜禽瘦肉比率有明顯作用。但是，β-激動(dòng)劑易在動(dòng)物體內(nèi)積聚殘留，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，容易造成急性或慢性食肉中毒。一旦攝入量過(guò)大，對(duì)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有刺激作用，會(huì)引起心悸、心慌、惡心、嘔吐、肌肉顫抖等臨床癥狀，甚至可能危及生命，嚴(yán)重危害人類健康。萊克多巴胺是一種人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑（俗稱β-興奮劑）類化合物，早在2002 年，我國(guó)就明令禁止其作為獸藥和飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用。

準(zhǔn)確檢測(cè)肉品中萊克多巴胺藥物殘留不僅在保障動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全方面有重要意義，而且有助于確保養(yǎng)殖環(huán)節(jié)依法、科學(xué)，為獸藥執(zhí)法監(jiān)管工作的有效開展提供有力的支撐。超高效液相色譜法常用于測(cè)定牛肉中食源性興奮劑類藥物殘留[1]，該研究采用HPLC-MS/MS 測(cè)定豬尿中萊克多巴胺藥物殘留，采用JJF-1059—2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[2]、JJF1135—2005 化學(xué)分析測(cè)量不確定評(píng)定[3]、CNASGL006—2019 化學(xué)分析中不確定度評(píng)估指南[4]等對(duì)其結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，對(duì)不確定度各分量進(jìn)行計(jì)算，找出影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的各種因素，為評(píng)定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC-MS/MS（AB 4500Q Trap）：配有電噴霧離子源（ESI），固相萃取裝置，萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（Dr），MCX 固相萃取柱（100 mg/3 mL），β-鹽酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶、甲醇、乙酸乙酯、異丙醇、乙酸銨、氫氧化鈉、甲酸（色譜純）。

1.2 樣品制備

取5 mL 豬尿樣品于50 mL 離心管內(nèi)，加入乙酸銨緩沖液0.5 mL（2 mol/L、pH 值5.2），加入40 μLβ-鹽酸葡萄糖苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋，37℃避光水浴振蕩16 h。酶解后，添加100 μL 100 ng/mL 內(nèi)標(biāo)物，渦旋，離心，pH 值調(diào)至9.8±0.2，加入10 mL 異丙醇-乙酸乙酯（6 ∶4）、1.5～2 g 固體氯化鈉飽和水相，渦旋振蕩，離心，重復(fù)提取一次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，用5 mL 2 mol/L 的乙酸銨溶液（pH 值5.2）溶解。MCX 柱子活化后，去備用液全部過(guò)柱，淋洗液淋洗，5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液氮?dú)獯蹈?。殘余物?.5 mL 0.1%甲酸溶解，上機(jī)分析?；|(zhì)標(biāo)定量。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7 μm），柱溫為40℃；進(jìn)樣體積10 μL，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相A 乙腈，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸水溶液，梯度為0～2 min，體積分?jǐn)?shù)為8%的B 溶液；2～6 min，體積分?jǐn)?shù)為8%～60%的B 溶液，6～6.5 min，體積分?jǐn)?shù)為60%～80%的B 溶液，6.5～7.5 min，體積分?jǐn)?shù)為80%的B 溶液，7.5～8 min，體積分?jǐn)?shù)為80%～8%的B 溶液。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子化模式為電噴霧正離子模式，質(zhì)譜掃描方式為MRM，離子源溫度為600℃、碰撞能量及定性定量離子質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。

2 不確定度分析與評(píng)定

2.1 數(shù)學(xué)模型

采用基質(zhì)外標(biāo)法定量，按下式計(jì)算萊克多巴胺藥物含量：

式中：X為樣品中待測(cè)組分含量（μg/mL）；C被測(cè)樣品濃度（μg/mL）；V1溶解殘余物所得試樣溶液體積；V2試樣體積（mL）。

上述公式依據(jù)樣品測(cè)定原理給出，未考慮隨機(jī)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。

2.2 不確定度來(lái)源

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程萊克多巴胺含量的計(jì)算公式，得到不確定度來(lái)源圖，見圖1。

圖1 萊克多巴胺藥物檢測(cè)過(guò)程中不確定度來(lái)源

2.3 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)估

2.3.1 測(cè)量重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由于分析過(guò)程中，很多操作引入的不確定度具有一定的重復(fù)性，如天平稱量，移液管轉(zhuǎn)移液體，容量瓶定容體積等操作等，因此，可以將此類分量進(jìn)行歸納，引入重復(fù)性，即精密度，用于分析研究過(guò)程中隨機(jī)變化引入的不確定度。精密度主要采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方式來(lái)進(jìn)行研究，對(duì)陽(yáng)性樣品中萊克多巴胺藥物含量進(jìn)行一系列平行測(cè)試，得到分析過(guò)程總隨機(jī)變化，以該標(biāo)準(zhǔn)化差值的標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估試驗(yàn)過(guò)程的重復(fù)性不確定度。

上述分量合并研究各種隨機(jī)因素，如體積讀數(shù)偏差、LC-MS/MS 的變動(dòng)，樣品混合不均勻以及HLB固相萃取小柱對(duì)回收率的影響等，后續(xù)評(píng)定其他分量時(shí)，不再考慮各種隨機(jī)因素。

表2 豬尿中萊克多巴胺含量 （mg/L）

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度。

綜上，在標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制時(shí)引入的不確定度由上述3 種組成，即：

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度人工配制濃度為1.00 mg/mL 萊克多巴胺儲(chǔ)備液，稀釋為0.500、1.00、2.00、5.00、10.0 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列，會(huì)引入不確定度，校正曲線為Ai=a+bCi，由工作曲線變動(dòng)性引起濃度c的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度

校正曲線各個(gè)參數(shù)如表6 所示。

表6 校正曲線引入不確定度計(jì)算

2.3.6 回收率u（R）引入不確定度在空白豬尿中加入10 μg/kg 的萊克多巴胺藥物，平行測(cè)定5 次，回收率結(jié)果見表7。

表7 豬尿中萊克多巴胺加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果及不確定度計(jì)算

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1 相對(duì)不確定度按照評(píng)定不確定度的測(cè)量模型計(jì)算萊克多巴胺含量的合成不確定度：

本次測(cè)定，樣品中萊克多巴胺為1.015 mg/L，則u=uc(X)×X=1.015×0.015 4=0.015 6 mg/L

2.4.2 擴(kuò)展不確定度根據(jù)國(guó)際慣例95%置信概率，取包含因子K=2，則擴(kuò)展不確定度為u(x)=k×u=2×0.015 6=0.031 2 mg/L。

2.4.3 檢測(cè)結(jié)果的表示用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬尿中萊克多巴胺，結(jié)果表示為（1.015±0.031 2）mg/L，其中擴(kuò)展系數(shù)為k=2。

2.5 不確定度評(píng)定

根據(jù)上述結(jié)果，制成相對(duì)不確定度直方圖（圖2）。由相對(duì)不確定度直方圖可以看出，對(duì)萊克多巴胺結(jié)果影響最大的是urel(Cs)，即標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、稀釋，其次是重復(fù)性操作urel(fr)及試樣的體積量取urel(V1)。

圖2 不確定度分量直方圖

3 討論與結(jié)論

不確定度的含義是指由于測(cè)量誤差的存在，對(duì)被測(cè)量值的不能肯定的程度，反過(guò)來(lái)，也表明該結(jié)果的可信賴程度。它是測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)。檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)豬尿中萊克多巴胺含量測(cè)定結(jié)果為1.015 mg/L 時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.031 2 mg/L（k=2），其中，引入不確定度主要的影響因素是標(biāo)準(zhǔn)品配制及稀釋、重復(fù)性操作及試樣體積量取。因此，在對(duì)豬尿中萊克多巴胺含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)盡量確保標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及稀釋精準(zhǔn)，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，同時(shí)多做平行樣，保證重復(fù)性操作的規(guī)范性，消除系統(tǒng)誤差帶來(lái)的影響，此類不確定度分量對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響，也為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制提供有效的測(cè)量數(shù)據(jù)。