劉卉琳 ，黃染林 ，曲 超 ，劉 紹

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南匯湘軒生物科技股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410323）

藍(lán)色是三原色之一，在食品、印染等行業(yè)有著重要的用途。自然界中并不缺少藍(lán)色素，然而目前用于食品加工的藍(lán)色素多為合成藍(lán)色素[1]，完全符合工業(yè)需求的天然藍(lán)色素卻很少見(jiàn)。隨著人們對(duì)食品質(zhì)量和商品安全性的要求不斷提高，天然色素的提取和應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)[2-4]。例如：陳林[5]從板藍(lán)根中提取靛藍(lán)色素對(duì)牛仔布紗線(xiàn)進(jìn)行染色試驗(yàn)，結(jié)果表明，天然靛藍(lán)具有良好的染色深度和染色牢度，可替代化學(xué)靛藍(lán)用于牛仔布的染色，特別是用于貼身穿著的襯衣和牛仔褲的中淺色染色，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害。

南板藍(lán)根別稱(chēng)馬藍(lán)、大青葉，是爵床科多年生草本植物，根莖葉均具有一定藥用價(jià)值[6]。研究發(fā)現(xiàn)，該藥材除了具有生物堿、黃酮、萜類(lèi)、木脂素類(lèi)等多種活性成分外[7-11]，其靛藍(lán)色素的含量也較高，且在特定光波長(zhǎng)下其吸光度與靛藍(lán)濃度（100～150 mg/mL）有較好的線(xiàn)性關(guān)系[12-13]。

常見(jiàn)的靛藍(lán)提取方法主要有微生物發(fā)酵和有機(jī)溶劑提取2 種[14-19]。其中，有機(jī)溶劑提取法成本較高，提取率低，且化學(xué)物質(zhì)殘留較多，有些還具有一定毒性，對(duì)靛藍(lán)后續(xù)應(yīng)用產(chǎn)生不利影響，對(duì)環(huán)境也不友好。而微生物發(fā)酵一般是將含靛藍(lán)的植物置于室溫發(fā)酵池內(nèi)浸泡7 d，待發(fā)酵池滋生大量微生物，散發(fā)出腐爛腥臭味后撈出，再往發(fā)酵池中加入一定比例的生石灰，用力攪拌1 h，直到有藍(lán)色泡沫浮起為止。該提取方法耗時(shí)較長(zhǎng)，產(chǎn)生的工業(yè)廢水多，環(huán)保壓力大。因此，如何縮短提取時(shí)間、提高提取效率，并盡量降低污染是目前天然靛藍(lán)色素提取急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。筆者以南板藍(lán)根為原料，首次探索了水酶法提取南板藍(lán)根中靛藍(lán)色素的工藝流程，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了工藝參數(shù)，該方法大大縮短了靛藍(lán)提取時(shí)間，提高了效率，且提取過(guò)程符合綠色環(huán)保要求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試原料為南板藍(lán)根干葉，于2021 年5—6 月在貴州采摘干燥。主要試劑有復(fù)合酶制劑（食品級(jí)，湖南尤特爾生物科技有限公司）、靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品（上海染料研究所）。主要儀器設(shè)備有電子天平（上海菁海儀器有限公司）、分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）、恒溫水浴鍋（北京國(guó)華醫(yī)療器械廠(chǎng)）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津冠澤科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南板藍(lán)根中靛藍(lán)色素提取的工藝流程稱(chēng)取南板藍(lán)根干葉，以蒸餾水為溶劑按一定比例混合，加入一定量的復(fù)合酶，調(diào)整pH 值后在水浴鍋中進(jìn)行恒溫提取，提取結(jié)束后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取液吸光度，測(cè)定3 次，取平均值。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定采用紫光分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)定。配制濃度為0.05 mg/mL 的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于312～812 nm 波長(zhǎng)[20]范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度的比較，確定靛藍(lán)色素最大的吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.3 樣品中色素提取率的計(jì)算精確稱(chēng)取0.000 2 g（精確至0.000 1 g）純度為95%的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成0.2 mg/L 靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。從中分別取1、2、3、4和5 mL 定容至100 mL 容量瓶中，配制成濃度為0.002、0.004、0.006、0.008 和0.010 mg/L 的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水作為參照，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后測(cè)定水酶法提取液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得提取液中的色素濃度，再根據(jù)公式（1）計(jì)算靛藍(lán)提取率。

式中，c為粗提靛藍(lán)濃度（mg/L），10 為稀釋10 倍，V為提取液體積（L），m為南板藍(lán)根質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)（1）提取溫度。在料液比為1 ∶20（g/mL）、加酶量為6 g/L、pH 值為5、提取時(shí)間為3 h 的條件下，將提取溫度設(shè)置為30、40、50、60 和70℃，研究提取溫度對(duì)靛藍(lán)色素提取率的影響。（2）提取時(shí)間。在料液比為1 ∶20、加酶量為6 g/L、pH值為5、提取溫度為50℃的條件下，分別提取1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 h，研究提取時(shí)間對(duì)靛藍(lán)色素提取率的影響。（3）加酶量。在料液比為1 ∶20、pH 值為5、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為3 h 的條件下，分別添加4、5、6、7 和8 g/L 的復(fù)合酶，研究加酶量對(duì)靛藍(lán)色素提取率的影響。（4）pH 值。在料液比為1 ∶20、加酶量為6 g/L、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為3 h 的條件下，調(diào)整pH 值為3、4、5、6 和7，研究pH 值對(duì)靛藍(lán)色素提取率的影響。（5） 料液比。在加酶量為6 g/L、pH 值為5、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為3 h的條件下，分別配置1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50的料液比，研究料液比對(duì)靛藍(lán)色素提取率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)靛藍(lán)色素提取率影響較大的3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以靛藍(lán)色素提取率為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由圖1 可知，靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液在612 nm 處呈現(xiàn)最高峰，因此將靛藍(lán)色素的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為612 nm。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)靛藍(lán)溶液吸收光譜曲線(xiàn)

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度由圖2 可看出，隨著提取溫度的增加，靛藍(lán)的提取率先升高后降低；當(dāng)提取溫度為30～70℃時(shí)，提取率從0.105%升到0.207%后又降至0.075%，變化差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明提取溫度對(duì)靛藍(lán)提取的影響較大，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)?0℃為復(fù)合酶的最適作用溫度，若溫度繼續(xù)升高，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，酶活性大大降低，導(dǎo)致提取率下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選定50℃為南板藍(lán)根中靛藍(lán)提取的最佳溫度。

圖2 不同提取溫度下的靛藍(lán)提取率

2.2.2 提取時(shí)間由圖3 顯示，隨著提取時(shí)間的增加，靛藍(lán)提取率先升高后降低，提取時(shí)間從1.5 h 增至3.5 h，靛藍(lán)提取率從0.173%升高至0.196%再降至0.183%，最大值與最小值之間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），但提取率居中的3 個(gè)處理間差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)靛藍(lán)提取的影響較小。當(dāng)提取時(shí)間為3.0 h 時(shí)，靛藍(lán)提取率達(dá)到最大值，3.0 h 后提取率呈現(xiàn)細(xì)微下降趨勢(shì)。這說(shuō)明提取時(shí)間達(dá)到3.0 h，酶與南板藍(lán)根已充分接觸和反應(yīng)，靛藍(lán)溶出已達(dá)到極限。超過(guò)一定時(shí)間，部分靛藍(lán)色素分解。因此，在該試驗(yàn)條件下南板藍(lán)根中靛藍(lán)提取的最佳時(shí)間應(yīng)為3.0 h。

圖3 不同提取時(shí)間下的靛藍(lán)提取率

2.2.3 加酶量由圖4 可看出，當(dāng)加酶量為4～8 g/L 范圍內(nèi)，靛藍(lán)提取率隨著加酶量的增加呈先升高后稍降低并趨于平緩的趨勢(shì)；以加酶量為6 g/L 的處理提取率最大，為0.189%；以加酶量為4 g/L 的處理提取率最低，為0.170%；二者差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），但其他3 個(gè)加酶量處理間的差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明加酶量對(duì)靛藍(lán)色素提取的影響較小。在加酶量為6 g/L 時(shí)靛藍(lán)提取率達(dá)到最高，表明提高加酶量可以增加分子之間的碰撞，加快反應(yīng)速度，顯著催化靛藍(lán)的生成，但當(dāng)南板藍(lán)根與復(fù)合酶充分結(jié)合后，繼續(xù)增加酶用量對(duì)靛藍(lán)生成沒(méi)有明顯作用。因此，在該試驗(yàn)條件下南板藍(lán)根中靛藍(lán)提取的最適加酶量應(yīng)為6 g/L。

圖4 不同加酶量下的靛藍(lán)提取率

2.2.4 pH值 由圖5 可得，依次調(diào)整pH 值為3～7，靛藍(lán)提取率從0.106%升高至0.202%再降至0.125%，靛藍(lán)提取率變化顯著（P＜0.05），說(shuō)明酶活力受pH值影響較大。這一變化的原因在于該試驗(yàn)用的復(fù)合酶以纖維素酶為主，其最適pH 值為5，高于或低于最適pH 值酶活性均受到影響，導(dǎo)致底物無(wú)法與酶有效結(jié)合，故靛藍(lán)提取率降低。因此，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)將pH值控制在5 左右。

圖5 不同pH 值下的靛藍(lán)提取率

2.2.5 料液比由圖6 可得，靛藍(lán)提取率在料液比為1 ∶20 時(shí)達(dá)到最大值，為0.187%，提高或降低料液比均會(huì)使靛藍(lán)提取率下降；料液比為1∶50時(shí)提取率最低，與最大值差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明料液比對(duì)靛藍(lán)提取的影響較大。當(dāng)溶劑過(guò)少時(shí)，南板藍(lán)根無(wú)法充分溶解在溶劑中，產(chǎn)生的靛藍(lán)較少；而溶劑過(guò)多時(shí)，南板藍(lán)根與溶劑已反應(yīng)完全，靛藍(lán)無(wú)法繼續(xù)溶出，與此同時(shí)，繼續(xù)加入溶劑會(huì)帶來(lái)新的雜質(zhì)，稀釋靛藍(lán)的濃度，使提取液中靛藍(lán)的相對(duì)濃度降低。因此，在該試驗(yàn)條件下南板藍(lán)根中靛藍(lán)提取的最佳料液比應(yīng)為1 ∶20。

圖6 不同料液比的靛藍(lán)提取率

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)表明，提取時(shí)間和加酶量對(duì)靛藍(lán)提取率的影響較小，因此選用提取溫度（A）、料液比（B）、pH 值（C）進(jìn)行3 因素3 水平正交試驗(yàn)（表1）。由表1 的極差（R）值可知，各因素對(duì)靛藍(lán)提取率影響程度最大的是提取溫度，其次是pH 值，最后是料液比；最優(yōu)工藝條件組合為A2B2C2，即提取溫度50℃、pH值為5、料液比1 ∶20。由于該條件不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9 個(gè)處理中，故需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果顯示，在最優(yōu)條件下測(cè)得提取率為0.218%，比正交試驗(yàn)9 個(gè)處理中最佳組合（A2B1C2）的提取率（0.214%）稍高，說(shuō)明A2B2C2具有可行性，是該研究獲取的南板藍(lán)根中靛藍(lán)提取最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2 可知，3 個(gè)因素對(duì)靛藍(lán)色素提取效果的影響程度不同。其中提取溫度對(duì)靛藍(lán)吸光度影響極顯著（P＜0.01），pH 值對(duì)靛藍(lán)吸光度的影響顯著（P＜0.05），料液比對(duì)靛藍(lán)吸光度影響不顯著（P＞0.05）。由F值大小可知，不同因素對(duì)吸光度影響的主次水平為A ＞C ＞B，提取溫度對(duì)吸光度的影響最大，料液比對(duì)吸光度的影響最小。

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

4 結(jié)論與討論

研究采用了水酶法對(duì)南板藍(lán)根中的靛藍(lán)色素進(jìn)行提取，以提取率為考察指標(biāo)，分析提取時(shí)間、提取溫度、加酶量、pH 值和料液比對(duì)靛藍(lán)色素提取效果的影響，優(yōu)化了水酶法提取靛藍(lán)色素工藝，結(jié)果表明，在料液比1 ∶20、加酶量6 g/L、pH 值5、提取溫度50℃和提取時(shí)間3 h 的條件下，靛藍(lán)提取率最高，為0.218%。該方法大大縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，且產(chǎn)生的污染較少，達(dá)到了綠色環(huán)保要求。所提取的靛藍(lán)色素可廣泛應(yīng)用于食品、日化、印染等領(lǐng)域。