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        內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2022-10-13 10:36:30解麗娟伍善東
        湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年9期

        解麗娟,肖 蕾,伍善東,程 偉

        (湖南省微生物研究院,湖南 長沙 410009)

        解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是廣泛存在于自然界的一種非致病細菌。據(jù)文獻報道,該菌抗菌譜廣,對鐮刀菌(Fusariumspp.)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、灰霉病菌(Botrytis cinereaPers.)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliaeKleb)、番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)均有較強的抑制作用[1-4],還可以分泌一些植物激素類物質(zhì),促進植物生長[5]。以該菌為資源進行生物防治具有對環(huán)境友好、對人畜毒害小、對植物副作用小等優(yōu)點,越來越受到人們的重視。

        課題組前期從油菜植株內(nèi)分離到一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3(菌株保藏號為CCTCC NO:M2014320)。杯碟法對峙試驗和盆栽試驗中均證明該菌株對油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)有很強的拮抗作用,同時還具有溶磷解鉀的能力。因此,筆者認為該菌株有望開發(fā)成植物病害生防制劑,用于油菜菌核病的生物防治。為了進一步提高L-4-3 菌株的發(fā)酵水平,通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了該菌株的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件,以期為該生防菌株的產(chǎn)業(yè)化利用提供支撐。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

        供試菌為內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3,菌株保藏號為CCTCC NO:M2014320,由筆者所在課題組篩選?;A(chǔ)培養(yǎng)基:淀粉20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L,pH 值7.0。

        1.2 試劑與儀器

        試驗所用生化試劑均為國產(chǎn)分析純,淀粉、黃豆粉等原料購自超市。20 L、50 L 全自動發(fā)酵罐(BIOTECH-20JS、BIOTECH-50JS)購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

        1.3 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)基成分的篩選

        1.3.1 種子液的制備將活化后的L-4-3 菌株接種于裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中,在30℃、180 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)20 h。

        1.3.2 培養(yǎng)基成分的篩選通過單因素試驗篩選適合菌株的最佳碳源、氮源、無機鹽,再用正交試驗法確定碳源、氮源的最佳添加量[6]。(1)碳源的篩選。分別以含量為20 g/L 的淀粉、乳糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源,500 mL 三角瓶中裝液量為100 mL,每個搖瓶中接入5 mL 種子液,于30℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h;采用平皿菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù),以菌液濃度為考察指標確定最優(yōu)處理。(2)氮源的篩選。分別以含量為20 g/L 的黃豆粉、酵母粉、魚粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源,其他條件和考察方法同上。(3)碳源、氮源的最適添加量確定。以最優(yōu)碳源、氮源進行正交試驗,確定各組分的最佳添加量,其他條件和考察方法同上。(4)無機鹽的篩選。分別添加1 g/L 的KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaCl、鉀長石替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機鹽,其他條件和考察方法同上。(5)無機鹽的最適添加量。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L的KH2PO4和NaCl 以 及0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的MgSO4·7H2O,其他條件和考察方法同上。

        1.4 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

        以優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。培養(yǎng)溫度設(shè)置為20、24、28、32、36℃[7],培養(yǎng)時間設(shè)置為44、48、52、56、60、64、68、72 h,初 始pH 值 設(shè)置為6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4,轉(zhuǎn)速設(shè)置為90、120、150、180、210 r/min,接種量設(shè)置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%,500 mL 三角瓶裝液量設(shè)置為40、60、80、100、120、140 mL,其他條件和考察方法同上。

        1.5 50 L 發(fā)酵罐驗證試驗

        采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行50 L發(fā)酵罐試驗,采用平皿菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)量,以菌液濃度為最終衡量指標。

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        試驗數(shù)據(jù)重復(fù)3 次取平均值,采用Excel 2007 軟件和SPSS 25 軟件進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計與分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)基成分的篩選

        2.1.1 最佳碳源、氮源的篩選從圖1 可知,當以甘露醇為碳源時,菌液濃度達到最大值,為9.3×108CFU/mL;以乳糖為碳源時,發(fā)酵液中的活菌數(shù)最少,為2.9×108CFU/mL,以淀粉為碳源時,菌液濃度為5.1×108CFU/mL。由圖2 可知,以酵母粉為唯一氮源時,菌液濃度達到最大值,為9.7×108CFU/mL,其余氮源處理的菌液濃度由高到低排列依次為胰蛋白胨>蛋白胨>黃豆粉>魚粉>硫酸銨。綜合考慮成本因素,甘露醇和淀粉、酵母粉和黃豆粉可分別作為最佳碳源、氮源進行下一步試驗。

        圖1 不同碳源處理發(fā)酵液中的菌液濃度

        2.1.2 碳源、氮源最適添加量的確定根據(jù)單因素試驗結(jié)果,適宜碳源為甘露醇和淀粉,適宜氮源為酵母粉和黃豆粉。為了確定各組分的最佳添加量,以這4種物質(zhì)為因素、以其添加量為水平設(shè)計L9(34)正交試驗,詳見表1。通過均值和極差分析發(fā)現(xiàn),各因素對L-4-3 菌株發(fā)酵液活菌數(shù)的影響由大到小排列依次為甘露醇>酵母粉>淀粉>黃豆粉。培養(yǎng)基碳源、氮源成分及含量的最優(yōu)組合為A1B2C3D3,即黃豆粉1.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、甘露醇10.0 g/L。

        表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

        2.1.3 無機鹽的篩選由圖3 可知,添加KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O 的處理菌液濃度基本相當,其中添加MgSO4·7H2O 的處理,菌液濃度最高,為6.6×108CFU/mL。后續(xù)試驗中選擇KH2PO4、NaCl 和MgSO4·7H2O 作為培養(yǎng)基的無機鹽成分。

        圖3 添加不同無機鹽發(fā)酵液的菌液濃度

        2.1.4 無機鹽最適添加量的確定由圖4 可知,隨著KH2PO4添加量的增加,菌液濃度呈先升高后降低的趨勢,當添加量為4.0 g/L 時,菌液濃度達最大值為5.9×108CFU/mL。由圖5 可知,隨著NaCl 添加量的增加,菌液濃度也隨之增加,當添加量為4.0 g/L 時,菌液濃度達最大值,為9.1×108CFU/mL,當添加量為5.0 g/L 時,菌液濃度反而降低。由圖6 可知,隨著MgSO4·7H2O 添加量的增加,菌液濃度呈先升高后降低的趨勢,當添加量為3.0 g/L 時,菌液濃度達最大值,為10.8×108CFU/mL。因此,最終確定培養(yǎng)基中無機鹽的最適添加量為KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。

        圖4 添加不同量的KH2PO4 對菌液濃度的影響

        圖5 添加不同量的NaCl 對菌液濃度的影響

        圖6 添加不同量的MgSO4·7H2O 對菌液濃度的影響

        2.2 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

        2.2.1 初始pH值 由圖7 可知,當培養(yǎng)基的初始pH值為6.0~7.2 時,發(fā)酵結(jié)束菌液濃度的變化不明顯;當初始pH 值為8.4 時,其菌液濃度最低,為3.4×108CFU/mL;初始pH 值為7.2 時,其菌液濃度最高,為7.1×108CFU/mL。因此,確定菌株L-4-3 的最適初始pH 值為7.2。

        圖7 初始pH 值對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        2.2.2 裝液量由圖8 可知,當500 mL 的三角瓶裝液量為40 mL 時,發(fā)酵結(jié)束時菌液濃度最高,為19.4×108CFU/mL,隨著裝液量的增加,菌液濃度逐漸降低。因此,確定菌株L-4-3 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳裝液量為40 mL/500 mL 三角瓶,即裝液量8%。

        圖8 裝液量對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        2.2.3 接種量由圖9 可知,當接種量為2.0 %時,菌液濃度達最大值,為12.8×108CFU/mL;繼續(xù)增加接種量,菌液濃度反而降低。因此,確定菌株L-4-3發(fā)酵培養(yǎng)的最適接種量為2.0 %。

        圖9 接種量對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        2.2.4 培養(yǎng)溫度由圖10 可知,隨著培養(yǎng)溫度的升高,菌株L-4-3 發(fā)酵結(jié)束時菌液濃度逐漸增加,當培養(yǎng)溫度為32℃時,菌液濃度達到最大值,為20.1×108CFU/mL,隨后,培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高,菌液濃度逐漸變小。因此,確定菌株L-4-3 的最適培養(yǎng)溫度為32℃。

        圖10 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        2.2.5 轉(zhuǎn)速 由圖11 可知,隨著轉(zhuǎn)速的增加,菌液濃度先升高后降低;當轉(zhuǎn)速為180 r/min 時,菌液濃度達最大值,為10.1×108CFU/mL。因此,確定菌株L-4-3 的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

        圖11 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        2.2.6 培養(yǎng)時間由圖12 可知,隨著培養(yǎng)時間的延長,發(fā)酵結(jié)束時菌液濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;當培養(yǎng)時間為68 h 時,其菌液濃度為最高,達到17.0×108CFU/mL;繼續(xù)增加培養(yǎng)時間,菌液濃度有所降低。因此,確定菌株L-4-3 的最適培養(yǎng)時間為68 h。

        圖12 培養(yǎng)時間對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

        綜合上述試驗結(jié)果,菌株L-4-3 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為初始pH 值7.2,裝液量8%,接種量2.0 %,溫度32℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)時間68 h。

        2.3 L-4-3 菌株50 L 發(fā)酵罐驗證試驗結(jié)果

        采用最適培養(yǎng)基配方即甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黃豆粉1.0 g/L、KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L,最適培養(yǎng)條件即初始pH 值7.2、裝液量8%、接種量2.0 %、溫度32℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間68 h,發(fā)酵結(jié)束采用平皿菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)為20.8×108CFU/mL。

        3 討論與結(jié)論

        近年來,微生物菌劑成為植保領(lǐng)域的研究熱點,關(guān)于解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報道較多[8-10]。在生產(chǎn)應(yīng)用中,有效活菌數(shù)是影響微生物菌劑的關(guān)鍵因素。因此,優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件,提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)是研發(fā)生防微生物菌劑的關(guān)鍵所在[2]。

        該研究從培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件2 個方面對內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3 的發(fā)酵水平進行了研究,碳源、氮源對L-4-3 菌株菌液濃度的影響依次為甘露醇>酵母粉>淀粉>黃豆粉,碳源、氮源最優(yōu)配比為甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黃豆粉1.0 g/L,無機鹽最適添加量為KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。搖瓶發(fā)酵最適培養(yǎng)條件為初始pH 值7.2、裝液量8%(500 mL 三角瓶裝液40 mL)、接種量2.0 %、溫度32℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間68 h。以優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行50 L 發(fā)酵罐驗證,發(fā)酵液中活菌數(shù)為20.8×108CFU/mL。

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