趙夢瀟，張鈺璇,2, 魏晨佳，曹 忻,2，楊具田,2，高丹丹,2★

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 730124；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 730030）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，人們對牛肉的消費(fèi)需求不斷上升，其中牛血液作為屠宰加工副產(chǎn)品而面臨著亟待解決的資源浪費(fèi)問題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，牛血液約占其活體重的4.0%～9.8%[1]，被屠宰后一般可收集到總血量60%～70%。新鮮血液中富含多種蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素，以及人體所需的無機(jī)鹽與鈉、鉀、鐵、鈣等元素[2]，但由于牛血液血腥味重、消化性差、食用率不高等因素，常作為屠宰廢棄物排放，不僅造成蛋白資源的浪費(fèi)，還給環(huán)境帶來極大的壓力[3]。

牛血液中蛋白質(zhì)含量在17%左右，其中以血清蛋白占比最高。畜禽動物血清蛋白水解后的多肽液易于被人體吸收利用，目前常采用酶解法水解血清蛋白制備生物活性肽，提高血液利用率和消化率。有研究報道酶解法可用于生產(chǎn)動物蛋白復(fù)合產(chǎn)品，以其低成本、高產(chǎn)量、生產(chǎn)條件溫和、方便操控的優(yōu)勢，逐漸受到人們的青睞。Adje[4]等采用胃蛋白酶水解牛血紅蛋白得到抑菌肽，湯鳳霞[5]等利用酶解法水解豬血制備食用水解蛋白，胡濱[6]利用胰蛋白復(fù)合酶法水解豬血蛋白制備游離氨基酸和功能肽，多項(xiàng)研究證明酶解法水解動物蛋白可制備高附加值的功能性肽。由此可見，采用酶法水解動物血清蛋白制備生物活性肽具有廣闊的發(fā)展前景。

本研究選用堿性蛋白酶水解蛋白，主要通過對比不同反應(yīng)溫度、pH、水解時間和加酶量的條件下堿性蛋白酶水解牛血清蛋白的水解度來分析水解牛血清蛋白的最適條件，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)對水解條件進(jìn)行優(yōu)化分析，為解決屠宰副產(chǎn)物血液資源的污染問題提出新的轉(zhuǎn)化思路和途徑，為牛血清蛋白和多肽的綜合利用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原材料 新鮮牛血：采自蘭州忠華牛羊屠宰場18 月齡肉牛。

1.1.2 試劑 堿性蛋白酶（酶活力200 U/mg），購自上海源葉生物有限公司；茚三酮、TCA、VC，均購自美國Sigma 公司；氫氧化鈉、檸檬酸鈉、鹽酸、正丁醇、正丙醇，均購自上海生工公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 pH 計(jì)（尤尼科儀器有限公司）；HW328型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；JA2003N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16M 高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；722 型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牛血清蛋白酶解液的制備工藝 新鮮牛血→抗凝血（2.5%檸檬酸鈉）→離心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液→醇沉離心（4℃，6500r/min，15min）→取上清液冷凍干燥（-20℃）→牛血清蛋白粉→5%牛血清蛋白溶液→調(diào)節(jié)pH（pH=12）→水解（堿性蛋白酶3000 U/g，55℃，5h）→滅酶（95℃，1min）→沉降蛋白質(zhì)（2mL 10% TCA）→離心（4℃，10000r/min，15min）→收集上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水解度的測定 采用羅艷華[8]、高丹丹[9]等人的方法測定氨基酸含量。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL 質(zhì)量濃度為100μg/mL 的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，加水補(bǔ)足至2mL，分別滴加 1.2%茚三酮顯色劑1mL和 1%的VC 0.1mL，混勻后95℃水浴保溫15min，冷卻至室溫，用40%的乙醇定容至40mL，在570nm 波長處測定溶液吸光值，并根據(jù)甘氨酸含量與吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的曲線回歸方程為y=0.0081x+0.014，R2=0.9983，由數(shù)據(jù)可見，在試驗(yàn)取值范圍內(nèi)甘氨酸含量與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

水解度（Degree of Hydrolysis，DH）的計(jì)算公式：

式中：Ah，酶解液中的總游離-NH2總量（mmol）；A0，原料蛋白中原有的總游離-NH2數(shù)（mmol）；A1，原料蛋白經(jīng)強(qiáng)酸水解后的總游離-NH2數(shù)（mmol）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為優(yōu)化牛血清蛋白水解工藝，取5 mL 的5%牛血清蛋白溶液作為底物，以牛血清蛋白的水解度為指標(biāo)，考察不同溫度（55℃、60℃、65℃、70℃、75℃）、pH（9、10、11、12、13）、水解時間（2、3、4、5、6h）和加酶量（1000、2000、3000、4000、5000U/g）對堿性蛋白酶水解效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為考察酶解溫度（A）、pH（B）、水解時間（C）和加酶量（D）四個單因素對蛋白水解程度的共同影響，以牛血清蛋白的水解度為響應(yīng)值設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并運(yùn)用Box-Behnken 進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

1.2.5 數(shù) 據(jù) 處 理 采 用Origin 9.0、Design-Expert.8.0.6、SPSS 25 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對牛血清蛋白水解度的影響 溫度對牛血清蛋白水解度的影響如圖1 所示，在50℃～70℃范圍內(nèi)，水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在65℃處水解度有最大值，為16.94± 0.24%。當(dāng)溫度超過65℃后，水解度與溫度呈負(fù)相關(guān)，這是由于超過酶解反應(yīng)的最適溫度會導(dǎo)致酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；當(dāng)水解溫度過高時，堿性蛋白酶還會失活，使酶解反應(yīng)受到抑制[10]。這與張志翔[11]等得到的時間延長會降低水解度的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符合。所以，確定最適的水解反應(yīng)溫度為65℃。

圖1 溫度對水解度的影響

2.1.2 pH 對牛血清蛋白水解度的影響 pH 對牛血清蛋白水解度的影響如圖2 所示，pH 在9 ～13 范圍內(nèi)，隨著pH 的增加牛血清蛋白水解度呈現(xiàn)先升高后明顯下降的趨勢，在pH 值為12 時，牛血清蛋白的水解度達(dá)到最大值，為18.07 ± 0.26%，這是由于當(dāng)pH 大于12 時，強(qiáng)堿會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[12]，抑制蛋白酶的活性，導(dǎo)致水解度降低。這與鄒澤斌[13]等得到的pH過大或過低均會降低蛋白質(zhì)水解度的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符合。所以，確定最適的水解反應(yīng)pH 為12。

圖2 pH 對水解度的影響

2.1.3 水解時間對牛血清蛋白水解度的影響 水解時間對牛血清蛋白水解度的影響如圖3 所示，在2 ～6h 范圍內(nèi)，水解度與反應(yīng)時間呈正相關(guān)的趨勢。在2 ～4h 內(nèi)，酶解反應(yīng)比較充分，牛血清蛋白的水解速率較大，而4h 后蛋白質(zhì)的水解速率減慢。這是由于反應(yīng)時間的延長使得反應(yīng)底物減少，且酶解產(chǎn)物增多增強(qiáng)了對酶的抑制作用，從而減緩了水解反應(yīng)[14]。綜合考慮經(jīng)濟(jì)和時間因素，確定最適水解時間為4h。

圖3 水解時間對水解度的影響

2.1.4 加酶量對牛血清蛋白水解度的影響 加酶量對牛血清蛋白水解度的影響如圖4 所示，在1000 ～5000U/g 范圍內(nèi)，水解度隨加酶量的變化呈正相關(guān)趨勢，但當(dāng)加酶量超過2000U/g后水解度增加趨勢緩慢。這是由于當(dāng)?shù)孜锍渥銜r，酶量的增加可以增強(qiáng)酶與底物的結(jié)合度，增大酶與底物的接觸率，從而提高了水解程度[15]。當(dāng)加酶量達(dá)到一定范圍后，由于酶濃度逐漸接近飽和，底物的量不斷減少，繼續(xù)提高加酶量不會對水解度造成顯著影響?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)耗能和生產(chǎn)成本的問題，確定最適加酶量為2000 U/g。

圖4 加酶量對水解度的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白結(jié)果分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn) 以5%牛血清蛋白溶液為反應(yīng)底物，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法分析堿性蛋白酶影響牛血清蛋白水解度高低的酶解工藝，并進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-17]，采用中心Box-Behnken 組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)出29 組實(shí)驗(yàn)，其中5 組為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對溫度、pH、酶解時間和加酶量四個單因素條件進(jìn)行優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得到二次回歸方程為：DH=23.19-0.20A-3.17B+1.61C+2.63D+0.033AB+0.10AC+0.13AD-0.86BC+0.14BD-0.62CD-1.72A2-4.87B2-1.56C2-2.24D2。對二次多元回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表

由上述方差分析表可知，總模型的P＜0.0001，說明該二次多元回歸模型具有高度的顯著性[18]。失擬項(xiàng)P=0.2617＞0.05，表示在失擬項(xiàng)α=0.05 水平上，由于非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果造成的影響不顯著。決定系數(shù)R2=0.9747，校正決定系數(shù)R2Adj 為0.9495，能解釋實(shí)驗(yàn)中94.95%響應(yīng)值的變化，實(shí)驗(yàn)誤差小，說明模型有良好擬合程度，該回歸方程可用于預(yù)測和代替堿性蛋白酶水解牛血清蛋白工藝研究中的試驗(yàn)點(diǎn)。

對所得回歸方程的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4，經(jīng)比較各因素在堿性蛋白酶水解牛血清蛋白過程中對水解度的影響，得到的結(jié)果為：B、C、D 對水解度影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.001），各因素對水解度的影響強(qiáng)弱為B＞D＞C＞A。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.2.2 響應(yīng)面分析和優(yōu)化 通過Design-Expert.8.0.6 軟件對回歸模型制作響應(yīng)曲面圖，探究溫度、pH、水解時間和加酶量之間相互作用產(chǎn)生的影響，以交互作用對水解度的影響程度作為分析依據(jù)來確定最佳因素水平的范圍。響應(yīng)曲面的陡峭程度能反映出牛血清蛋白質(zhì)的水解度對試驗(yàn)因素的敏感程度，響應(yīng)面坡度平緩表示水解度對于因素的變化不敏感，坡度陡峭表示水解度對于因素的變化非常敏感[18]。由圖5 可知，溫度和pH、pH 和水解時間、pH 和加酶量的交互作用形成的響應(yīng)曲面坡度比較陡峭，且在pH 變化方向上曲線變化明顯；而溫度和水解時間、溫度和加酶量、水解時間和加酶量交互作用形成的曲面圖則比較平緩，且在溫度變化方向上曲線變化最平緩。結(jié)合顯著性分析結(jié)果比較，說明pH、水解時間和加酶量的交互效應(yīng)對堿性蛋白酶水解牛血清蛋白影響顯著，且pH 對蛋白水解度的影響最大，溫度對水解度的影響最小。

圖5 兩因素交互作用對水解度的曲面圖

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)和二次多項(xiàng)回歸方程模型結(jié)果，在牛血清蛋白水解度達(dá)到最高值的基礎(chǔ)上優(yōu)化溫度、pH、水解時間和加酶量四個因素，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件為：酶解溫度64.85℃、pH11.64、水解時間4.52h、加酶量2500U/g，水解度可達(dá)到24.85±0.15%。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在預(yù)測的最佳條件下開展水解實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)平行測定3 次得到的水解度結(jié)果為24.76%、25.02%、24.83%，經(jīng)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）=0.001098，表明該模型能比較好地預(yù)測實(shí)際水解情況。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過考察溫度、pH、水解時間、加酶量對堿性蛋白酶水解牛血清蛋白水解度的影響，利用響應(yīng)面法對影響水解條件的因素進(jìn)行探究，優(yōu)化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白最佳工藝參數(shù)，考慮到實(shí)際操作條件，最終確定最佳水解條件為溫度65℃、pH 11.6、水解時間4.5h、加酶量2500U/g，經(jīng)優(yōu)化得到的水解度可達(dá)到24.85±0.15%。本實(shí)驗(yàn)研究證明，響應(yīng)面分析法可以有效的優(yōu)化堿性蛋白酶水解牛血清蛋白工藝條件，提高牛血清蛋白的利用率和血液資源的利用，減少浪費(fèi)，保護(hù)環(huán)境，防止血液污染，也給牛血清的開發(fā)和利用帶來更廣闊的應(yīng)用前景。