張 華，姜 慶，李 杰，吳 迪，張 新

（臨沂市檢驗(yàn)檢測中心，山東臨沂 276000）

銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為需氧、無芽孢、有運(yùn)動(dòng)能力以及乳糖非發(fā)酵革蘭染色陰性桿菌，是一種常見的條件致病菌，常見于各種感染性疾病，如尿路感染、呼吸系統(tǒng)感染、軟組織感染和各種全身感染，尤其是在燒傷患者和免疫缺陷患者中[1-2]。銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，能夠適應(yīng)不同環(huán)境，且代謝多樣，涵蓋范圍廣泛，包括土壤、水（熱水浴缸、水槽、水龍頭、呼吸機(jī)和消毒水）、植物及動(dòng)物、空氣及其他富含水的場所（游泳池）[3-5]。

飲用水微生物污染是一個(gè)常見問題，對(duì)公眾健康有著嚴(yán)重的影響。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，常在飲用水中檢測到。此外，人們?cè)絹碓街匾曂把b飲用水和礦泉水的銅綠假單胞菌污染情況。近些年來，國內(nèi)外對(duì)桶裝水或瓶裝水中檢測出銅綠假單胞菌的情況報(bào)道日益增多，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌不合格率大于10%[6-7]。

我國最新飲用水標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲水》（GB 19298—2014）中微生物限量規(guī)定，按照二級(jí)采樣方案，同一批次的5份水樣品要求每份水樣品里不得檢出銅綠假單胞菌。如果檢出，則判定為不合格[8]。因此，銅綠假單胞菌檢測在食品安全檢驗(yàn)中具有重要意義。盲樣考核是為了保證各級(jí)食品安全承檢機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提高檢驗(yàn)檢測水平，并以監(jiān)督和考核為目的的測評(píng)活動(dòng)。臨沂市檢驗(yàn)檢測中心參加了2022年由山東省市場監(jiān)督管理局組織的盲樣考核活動(dòng)，檢驗(yàn)項(xiàng)目為“飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗(yàn)”，結(jié)果為滿意。為提高實(shí)驗(yàn)室工作質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

收到編號(hào)為TL048的銅綠假單胞菌質(zhì)控樣凍干粉1瓶，在棕色西林瓶內(nèi)有白色粉末狀樣品，避光儲(chǔ)存于-20 ℃；樣品中的菌含量為0～1.0×106CFU/250 mL；實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株：陽性對(duì)照菌株為銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC21636），陰性對(duì)照菌株為熒光假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC21620），從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心采購。

1.2 培養(yǎng)基

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN平板）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、乙酰胺肉湯和綠膿菌素測定培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基都在保質(zhì)期內(nèi)，從北京陸橋股份有限公司采購；VITEK2 GN卡，法國生物梅里埃公司。

1.3 儀器設(shè)備

VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，法國生物梅里埃公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO；ZGP-2270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海智誠公司；ZF-2型三用紫外儀，上海安亭電子儀器廠；MLS3780高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；HTY-2000B集菌儀，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；0.45 μm薄膜過濾器，北京牛牛基因技術(shù)有限公司；微量移液槍，Gilson公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品溶解

按照作業(yè)指導(dǎo)書，取出盲樣考核樣品并在室溫下放置5 min，在生物安全柜內(nèi)將銅綠假單胞菌質(zhì)控品的瓶子打開，樣品開啟后加入5 mL滅菌去離子水溶解混勻，然后轉(zhuǎn)移至裝有980 mL滅菌去離子水的三角瓶中。隨后，樣品瓶中再加入5 mL滅菌去離子水進(jìn)行潤洗，潤洗液轉(zhuǎn)移至該三角瓶，潤洗步驟重復(fù)3次。最終可得到1 L原液。

1.4.2 樣品稀釋

250 mL原液用于直接檢測，剩余原液用于10倍系列稀釋后檢測。10倍系列稀釋方法是取100 mL原液加入900 mL滅菌去離子水，混勻得到稀釋10倍的樣品稀釋液，以此方法稀釋到10-4。

1.4.3 樣品過濾

樣品在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過濾操作。首先將0.45 μm孔徑的薄膜過濾器固定在集菌儀上，然后開始抽吸水樣，等濾膜濕潤后，將薄膜過濾器通氣孔關(guān)閉，開始過濾。薄膜過濾器內(nèi)水樣完全過濾后，使用無菌鑷子小心地從濾膜邊緣將過濾后的濾膜夾起，平鋪到CN瓊脂平板上，集菌的濾膜面朝上。

1.4.4 培養(yǎng)

把CN平板倒置，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h。在培養(yǎng)過程中勤于觀察，可分別在20～24 h和40～48 h觀察濾膜上菌落的生長情況及計(jì)數(shù)。同時(shí)做陽性和陰性對(duì)照[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CN平板觀察與計(jì)數(shù)

按照盲樣作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）操作，從原液至10-4稀釋度進(jìn)行取樣檢測，TL048樣品在原液、10-1、10-2稀釋度的平板中只生長出一種特征的典型菌落，為綠色菌落，沒有其他可疑菌落生長，結(jié)果見表1。

表1 CN平板上計(jì)數(shù)結(jié)果表

2.2 確證性實(shí)驗(yàn)

TL048考核樣品在稀釋10倍的CN平板上只生長綠色菌落。在暗室中，將紫外儀波長365 nm的開關(guān)打開，紫外燈照CN平板，發(fā)現(xiàn)綠色菌落產(chǎn)熒光，注意不可長時(shí)間紫外燈照射，以免影響菌落生長。將綠色菌落轉(zhuǎn)接到綠膿菌素斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行綠膿菌素抽提實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示綠膿菌素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，則判定該綠色菌落是銅綠假單胞菌。同時(shí)，使用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果顯示99%為銅綠假單胞菌。最終菌落計(jì)數(shù)為2.6×102CFU/250 mL，見表2。

表2 鑒定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核樣品，飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗(yàn)在CN平板計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果為2.6×102CFU/250 mL，Z值小于2，評(píng)價(jià)結(jié)果滿意。由此可見該實(shí)驗(yàn)室具備銅綠假單胞菌定量檢測的能力。

自2019年以來，《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》將銅綠假單胞菌指標(biāo)作為包裝飲用水的重點(diǎn)監(jiān)測項(xiàng)目之一。目前《食品安全國家 包裝飲用水》（GB 19298—2014）標(biāo)準(zhǔn)要求的銅綠假單胞菌檢驗(yàn)項(xiàng)目為定量檢驗(yàn)，按照二級(jí)采樣方案，每批次5份水樣品，每份水樣都不得檢出（0 CFU/250 mL），如檢出，則判定為不合格，由此看出，銅綠假單胞菌的定量檢測是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要項(xiàng)目。所以，在進(jìn)行盲樣考核等實(shí)驗(yàn)過程中，以下問題應(yīng)該引起人們的注意。①實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真閱讀作業(yè)指導(dǎo)書，作業(yè)指導(dǎo)書對(duì)本次盲樣考核的樣品、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果記錄等有特別要求。例如，本次盲樣考核要求樣品每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行梯度稀釋，而《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》（GB 8538—2018）檢驗(yàn)方法中未有明確要求。②實(shí)驗(yàn)前做好準(zhǔn)備工作，包括儀器設(shè)備的校準(zhǔn)、試運(yùn)行以及培養(yǎng)基試劑是否齊全。有條件的實(shí)驗(yàn)室可以購買質(zhì)控樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，提前發(fā)現(xiàn)問題并進(jìn)行解決。③定量檢測項(xiàng)目一般在作業(yè)指導(dǎo)書中表明樣品含量水平，可多做幾個(gè)稀釋度，確保結(jié)果準(zhǔn)確。④保持CN平板表面干燥，防止菌落蔓延生長，將過濾膜貼在平板上時(shí)要保持平整，不能留有空隙，避免后續(xù)影響銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)。⑤銅綠假單胞菌在生化鑒定時(shí)，由于國標(biāo)方法檢測耗時(shí)較長，可借助VITEK2鑒定儀輔助鑒定，進(jìn)而提高鑒定效率。⑥銅綠假單胞菌在培養(yǎng)48 h后，菌落生長較大，容易連成片，不易觀察計(jì)數(shù)。因此，可在培養(yǎng)20～24 h和40～48 h后分別觀察濾膜上菌落的生長情況。⑦按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行樣品梯度稀釋時(shí)，若樣品總體積為1 L，則應(yīng)選取2 L的三角瓶或無菌均質(zhì)袋，確保水樣能夠徹底混合均勻。⑧銅綠假單胞菌為條件致病菌，實(shí)驗(yàn)所用的量筒、三角瓶和薄膜過濾器等應(yīng)121 ℃高壓滅菌30 min以上，按照規(guī)定處理，防止污染環(huán)境。