羅達(dá)龍，王 華，覃 藍(lán)，蔣德莉，文俊萍，楊梓瑩，宋 妤

（1.梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州 543000；2.梧州市天譽(yù)茶業(yè)有限公司，廣西梧州 543000；3．廣西速溶六堡茶工程技術(shù)研究中心，廣西梧州 543000）

六堡茶是具有獨(dú)特檳榔香氣的黑茶品種，屬于后發(fā)酵茶。六堡茶湯色紅濃明亮，口感醇和爽滑，香氣純陳，具有越陳越香的特性。貯存年份對(duì)六堡茶的品質(zhì)以及茶葉中茶多酚、氨基酸、茶黃素、茶紅素和茶褐素等內(nèi)含成分都會(huì)產(chǎn)生影響[1-5]。茶色素是茶葉體內(nèi)具有生物活性的一系列天然色素的總稱，主要由水溶性色素和脂溶性色素組成。六堡茶含有兒茶素、氨基酸、咖啡堿、維生素等生物活性物質(zhì)，不同陳化時(shí)間的六堡茶中茶褐素含量在9.49%～16.29%。隨著陳化時(shí)間的增加，六堡中茶色素含量逐漸增加，且增加明顯。

目前只有《紅茶中茶紅素和茶褐素含量的測定分光光度法》（NY/T 3675—2020）進(jìn)行紅茶中茶褐素的測定，而紅茶的基質(zhì)與六堡茶差異較大，標(biāo)準(zhǔn)中的羅勃茲經(jīng)驗(yàn)系數(shù)不適用于六堡茶中茶色素的測定，得到的結(jié)果與實(shí)際情況相差較大，不能準(zhǔn)確獲得六堡茶中茶色素含量。六堡茶在降糖、降脂、抗氧化方面有一定功效，而茶色素在這些功效中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，故建立一種能對(duì)六堡茶中茶色素進(jìn)行定量測定的方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用該方法分析10個(gè)不同批次的六堡茶中茶色素含量，該方法的重復(fù)性、回收率、線性關(guān)系、靈敏度均較好，適用于六堡茶中茶色素含量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六堡茶樣品均來源于廣西。

無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二甲基亞砜（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)ELGA PURELAB Classic UVF凈化系統(tǒng)制備的去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；GC 7890B-7000C配備7697A頂空進(jìn)樣器氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；EZ-2平行濃縮儀（英國Genevac公司）；PURELAB Classic UVF超純水機(jī)（英國ELGA公司）；XA205DU電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；FD115鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(德國Binder公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶色素對(duì)照品制備

取30批經(jīng)過評(píng)茶師評(píng)定等級(jí)為1級(jí)的六堡茶樣品，各批次稱取150 g，混合得到標(biāo)準(zhǔn)六堡茶樣品，隨后將該標(biāo)準(zhǔn)六堡茶樣品與沸水按1∶10的比例進(jìn)行浸泡，并在沸水浴中密封提取40 min，提取2次。使用紗布趁熱過濾提取后茶湯（過濾接收容器放置于冰浴中），收集到的茶湯使用平衡濃縮儀濃縮后得標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。向標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液加入無水乙醇試劑，加入無水乙醇的量占溶液總量的90%，混合均勻后放置到4 ℃冰箱靜置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物1。向沉淀物1加入乙酸乙酯試劑，加入乙酸乙酯的量占溶液總量的90%，混合均勻后放置到4 ℃冰箱靜置3 h，9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物2。沉淀物2在（65±2）℃烘箱下烘干1.5 h，得到茶色素粗品。取茶色素粗品5 g，用超純水溶解至100 mL，通過濾膜（＞50 000 Da的濾膜），再使用冷凍干燥得到茶褐素精品，作為茶色素對(duì)照品。

采用頂空-氣相色譜質(zhì)譜法（Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-GC-MS）對(duì)茶色素對(duì)照品中的殘留溶劑乙醇、乙酸乙酯進(jìn)行測定，使用公式[純度=100%-殘留溶劑含量（%）]計(jì)算出對(duì)照品的純度，以完成茶色素對(duì)照品純度的標(biāo)定，茶色素對(duì)照品需避光密封保存在2～8 ℃冰箱。

1.3.2 茶色素對(duì)照品中乙醇、乙酸乙酯殘留溶劑測定

（1）色譜條件。DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：20∶1；色譜柱溫度：初始溫度40 ℃，保持時(shí)間5 min，以20 ℃·min-1升至200 ℃，保持時(shí)間3 min，以60 ℃·min-1升至240 ℃，保持時(shí)間1 min；柱流量：1.2 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源溫度：230 ℃；電子能量；70 eV；選擇離子檢測（SIM）；乙醇離子質(zhì)荷比：30、31、45、46；乙酸乙酯離子質(zhì)荷比：43、45、61、70和88；頂空進(jìn)樣器加熱箱溫度：90 ℃；定量環(huán)溫度：100 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；樣品瓶平衡時(shí)間：15 min；進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間：0.5 min。

（3）供試樣品制備。精密稱取茶色素對(duì)照品0.50 g，置5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，搖勻，吸取3.00 mL到20 mL頂空瓶內(nèi)，待測定。

（4）對(duì)照品溶液配制。精密稱取無水乙醇、乙酸乙酯試劑各1.00 g，置100 mL容量瓶（容量瓶內(nèi)預(yù)先加入二甲基亞砜試劑80 mL），用二甲基亞砜試劑溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.10 mL置于5 mL容量瓶，加水溶解并定容至刻度，搖勻，吸取3.00 mL到20 mL頂空瓶內(nèi)，待測定。

1.3.3 六堡茶樣品前處理

精密稱取10個(gè)不同批次六堡茶樣品各5.00 g，加入沸水（由超純水煮沸得到）250 mL，攪拌均勻后在沸水浴中密封提取40 min，溶液趁熱過濾（過濾接收容器放置于冰浴中）后放至室溫，向?yàn)V液中加入無水乙醇試劑，加入無水乙醇的量占溶液總量的90%，混合均勻，4 ℃冰箱靜置3 h，在9 000 r·min-1下4 ℃冷凍離心15 min，得到沉淀物。將沉淀物用水溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，精密吸取上述稀釋液0.50 mL到50 mL容量瓶，用水定容至刻度，搖勻，得到樣品待測溶液。

1.3.4 六堡茶樣品測定

樣品待測溶液使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，測定波長為280 nm±2 nm，比色皿厚度1 cm，以超純水作為空白調(diào)零，測定樣品吸光度。樣品中茶褐素吸光度應(yīng)落在0.1～0.7，如吸光度過高需對(duì)樣品作進(jìn)一步稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

取1.3.1項(xiàng)下對(duì)照品，精密稱定，加水稀釋成濃度約1 000 μg·mL-1，作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取該儲(chǔ)備液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL和1.25 mL至10 mL容量瓶中，并1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（x），吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求得回歸方程為A=0.004 97x+0.027 45，茶色素標(biāo)準(zhǔn)曲線在25.66～128.30 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.997。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取10個(gè)不同批次的六堡茶樣品，每個(gè)批次稱取6份，每份5.00 g，精密稱定，按1.3.3項(xiàng)下方法提取供試品溶液，1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，測得10個(gè)不同批次六堡茶樣品茶色素的平均含量在9.7%～14.2%，RSD分別為2.3%～4.2%，試驗(yàn)表明該提取方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表1。

表1 10批六堡茶樣品茶色素含量的重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已測定含量的六堡茶樣品，分別加入相當(dāng)于樣品中茶色素含量的0.5%、5.0%、15.0%對(duì)照品，每個(gè)級(jí)別進(jìn)行3次加標(biāo)試驗(yàn)。按1.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。加標(biāo)量在0.5%～15.0%時(shí)，平均回收率為92.6%～106.2%，結(jié)果見表2。

表2 基質(zhì)加標(biāo)回收率結(jié)果（n=3）

2.4 定量限試驗(yàn)

在空白溶液中精密加入適量1.3.1項(xiàng)下對(duì)照品，按1.3.3項(xiàng)下方法提取供試品溶液，1.3.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，茶色素吸光度應(yīng)落在0.1～0.7，并以吸光度值最低點(diǎn)濃度作為定量限，得到該方法中茶色素的定量限為0.5%。

2.5 樣品測定結(jié)果

10個(gè)不同批次的六堡茶樣品茶色素含量為9.7%～14.2%，結(jié)果見表3。

表3 10批次六堡茶樣品茶色素含量檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本方法通過使用頂空-氣質(zhì)色譜質(zhì)譜法對(duì)純化過程中的殘留溶劑進(jìn)行測定，來標(biāo)定茶色素的純度。頂空-氣相色譜質(zhì)譜法對(duì)于殘留溶劑的檢測比氣相色譜法靈敏度更高，且質(zhì)譜抗干擾能力更強(qiáng)，使用質(zhì)荷比進(jìn)行定性可以排除在氣相色譜法法中由于色譜峰的干擾而導(dǎo)致的檢測目標(biāo)物檢測不到的因素。頂空-氣相色譜質(zhì)譜法使用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，設(shè)定加熱箱溫度只在殘留物的沸點(diǎn)以上，可保證其余高于該沸點(diǎn)的物質(zhì)不被揮發(fā)，不進(jìn)到檢測系統(tǒng)，進(jìn)而減少污染。得到茶色素對(duì)照品后該對(duì)照品用于檢測六堡茶中茶褐素，在基質(zhì)上對(duì)照品的來源為六堡茶，使用同樣基質(zhì)來源的對(duì)照品進(jìn)行檢測能進(jìn)一步排除由于基質(zhì)不同而影響測定結(jié)果的因素。

通過該方法制備茶色素對(duì)照品，對(duì)六堡茶樣品中的茶色素進(jìn)行測定，重復(fù)性、回收率、線性關(guān)系和靈敏度都較好，適用于六堡茶中茶色素含量的測定。