陳 媚，馮紅玉，徐 麗，劉迪發(fā)，姚碧嬌，符小琴，高 玲

[中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(儋州)分中心，海南儋州，571737]

全球西番蓮屬植物約有520個種，它們在形態(tài)、農(nóng)藝性狀等方面都存在較為豐富的差異，其遺傳多樣性研究與應(yīng)用起步較晚[1]。1988年，我國開始廣泛引進并種植西番蓮，但品種較為單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄[2]，育種與規(guī)?；N植受到限制。實際生產(chǎn)中，西番蓮種質(zhì)資源保護和新品種培育尤為重要。

西番蓮屬植物大多數(shù)屬于二倍體(Passifloraedulis，2n=2x=18))，是典型兩性花植物，但雌蕊和雄蕊發(fā)育時間不一致，自花授粉結(jié)果率較低，異花授粉為提高其遺傳多樣性和雜交育種提供了條件。

國外西番蓮的雜交育種較為活躍，尤其是觀賞西番蓮的種間雜交，而我國西番蓮資源評價與育種起步較晚。芽變是一種簡易而又有效的選育新品種的方法，但因芽變常源于芽端體細胞的突變，變異常限于個別基因的表型效應(yīng)，故芽變育種在變異范圍和幅度上存在一定局限性[3]，僅適于現(xiàn)有品種的修繕和改良，原始創(chuàng)新的突破則需開展雜交育種。

近年，我國西番蓮種內(nèi)雜交、種間雜交工作取得一定進展?；ǚ凼侵参锏男叟渥芋w，是開花植物遺傳信息的載體和交流工具，是植物有性繁殖過程所必需的材料[4]。父本具有良好的花粉活力是成功進行雜交育種的重要條件[5]。不同品種或不同種的花粉特性不同，熟悉其花粉特性可以提高種質(zhì)創(chuàng)制與雜交育種的效率。因而，檢測西番蓮屬花粉活力可以提前預(yù)知花粉發(fā)芽可靠程度，對提高繁殖效率和實施雜交育種具有非常重要的意義。

阻抗流式細胞儀法(IFC)是一種利用阻抗流式細胞儀，無需染色，實時不間斷檢測單個細胞在電場中的阻抗，以點圖顯示活性花粉百分比率的方法，具有可靠、快速、無破壞性等優(yōu)點[6-7]，目前榛子、小麥、玉米等作物上均有應(yīng)用[8-10]。本文使用IFC測定比較部分西番蓮品種花粉活力，為授粉和花粉收集保存提供參考，從而為西番蓮雜交育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年12月16—19日和2021年3月24—26日分別開展試驗，小黃金1號Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、大黃金1號Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、臺農(nóng)P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、滿天星P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、紅花西番蓮P.miniataVanderplank和紫花西番蓮Passiflora×violaceaVell.等6個西番蓮品種，來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所十隊基地西番蓮種質(zhì)資源保存圃。

1.2 儀器

花粉活力分析儀Ampha Z30-Pollen Analyzer，瑞士Amphasys公司產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集 選取發(fā)育正常，當天即將開花的花朵，從開放前開始取樣，約2 h取樣1次，每次用鑷子取同朵花上花藥1粒放入1.5 mL離心管中備用。

1.3.2 花粉活力測定 用移液槍移取緩沖Buffer 0.75 mL至裝有花藥的離心管中，通過震蕩、輕彈或放入試管架快速撥動離心管使花粉分散懸浮于緩沖液中；使用孔徑100 μm過濾塞將花粉懸浮液過濾到5 mL樣品管中，再次移取Buffer 0.75 mL沖洗離心管，并將沖洗液過濾到樣品管中，得到待測花粉懸浮液；花粉懸浮液靜止平衡2～3 min，重新翻轉(zhuǎn)混勻后立即上樣測試；測試得到象限散點圖，通常散點圖分為兩個明顯類群，當出現(xiàn)1個類群時，需要同規(guī)格失活對照確定類群的狀態(tài)，通過失活對照準確區(qū)分測試樣品的活性類群及失活類群。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過定義坐標軸“Phase”(花粉相對活性)及“Ampl”(花粉相對大小)范圍調(diào)整象限散點圖到最佳效果；統(tǒng)一測試樣品坐標軸，并根據(jù)散點圖分布情況設(shè)置門控，門控左側(cè)為失活花粉粒比例，右側(cè)為活性花粉粒比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力動態(tài)變化分析

小黃金1號大致開花時間為11：00—13：00，閉合時間為18：00以后。由圖1可知，小黃金1號在開花散粉前至花朵閉合前花粉活力均較強，活性花粉比例均達到了80%以上，測試時間活性花粉比例分別為86.88%、88.30%、94.19%、94.96%和87.13%，其中花粉活力12：00—15：00最強。

圖1 不同時間小黃金1號西番蓮失活和活性花粉比較

大黃金1號開花時間為14：00左右，為取樣方便，從第一次取樣開始，將待采花粉花蕾枝條帶回實驗室用自來水浸泡防止其缺水。由圖2可知，從08：47起至次日15：11，大黃金1號活性花粉比例分別為51.40%、83.59%、8.18%、39.23%、14.44%?；ǚ刍盍?2：54起驟降，為驗證其原因，于次日14：16起，每隔15 min按原取樣方法再從室外取另1朵花的花粉進行測定，活性花粉比例分別為88.5%、91.75%、91.72%、95.51%，遠遠高于前1天同期測定的花粉活力，初步推測大黃金1號花粉活力對環(huán)境較為敏感，置于室內(nèi)時間過長可能導致花粉活力嚴重下降。同時也不排除同朵花個別花藥發(fā)育成熟度低或發(fā)育缺陷(如活性花藥比例8.18%所采用的花藥)。

圖2 不同時間大黃金1號西番蓮失活和活性花粉比較

臺農(nóng)花朵上午未開放前便開始散粉，并且花粉活力一直保持80%以上高活性，直到18：00后，花朵將閉合前花粉活力迅速降低。經(jīng)觀察，臺農(nóng)花朵集中開放時間為11：30左右。由圖3可知，不同時間活性花粉比例分別為86.67%、86.44%、87.85%、86.49%、86.95%、40.5%。

圖3 不同時間臺農(nóng)西番蓮失活和活性花粉比較

由圖4可知，滿天星一天的花粉活力明顯呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，13：00花朵開放前后達到最大值。08：24花藥未散粉，此時花粉活力最低，活性花粉比例為59.56%；10：25活性花粉比例為70.66%；12：21和13：17這兩個時間點的活性花粉比例較高，分別為87.86%、85.25%；14：28活性花粉比例為82.36%；15：23花粉活力開始明顯下降，此時活性花粉比例為62.76%。

圖4 不同時間滿天星西番蓮失活和活性花粉比較

紅花西番蓮?fù)ǔＡ璩块_花夜晚閉合。取樣時，第二天將開放的花蕾于前一天17：40取花粉進行測定，后面采樣為次日08：00后進行，此時花已完全開放。由圖5可知，紅花西番蓮花粉活力呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，10：19活性花粉比例最小，只有38.26%；13：15活性花粉比例最大，為81.77%；其他時間的活性花粉比例在50%～70%之間。

圖5 不同時間紅花西番蓮失活和活性花粉比較

紫花西番蓮開花時間在14：00左右，花朵完全開放1 h后開始散粉，花粉活力在開花當天始終極低，由圖6可知，各時間點的活性花粉比例分別為2.7%、4.54%、5.14%、5.97%、6.01%。

圖6 不同時間紫花西番蓮失活和活性花粉比較

2.2 不同品種花粉活力比較

由表1可知，不同品種西番蓮花粉活力不同。小黃金1號和臺農(nóng)活性花粉比例大于80%的時間最長，均為08：00—17：00，持續(xù)9 h；而滿天星持續(xù)3 h，大黃金1號持續(xù)6 h；紅花持續(xù)時間最短，僅1 h。整體上看，5個品種花粉活力峰值均在中午至下午出現(xiàn)，臺農(nóng)和滿天星花粉活力最早達到峰值，時間均為12：00—13：00，其次為紅花，再次為小黃金1號，大黃金1號最晚。黃果類西番蓮活性花粉比例較高，小黃金1號為94.96%，大黃金1號比小黃金1號稍高，為95.51%，均達到了90%以上。紫果類西番蓮花粉活性較黃果類稍低，臺農(nóng)和滿天星的活性花粉最高比例分別為87.85%和87.86%，兩者極為相近。紅花作為觀賞品種，花粉活力較低，活性花粉最高比例為81.77%。供試品種花粉活力衰減的速度也不一樣，紅花的花粉活力衰減速度最快，15：00以后活性花粉比例就已下降至53.20%；滿天星在15：00以后活力花粉也衰減到了63.76%；小黃金1號花粉活力從16：00以后開始衰減，但此時的活性花粉比例仍高達87.13%；臺農(nóng)在18：00以后花粉活力出現(xiàn)明顯衰減，低至40.50%。

表1 不同品種西番蓮花粉活力比較

2.3 不同季節(jié)和不同環(huán)境的影響

分別于2020年12月16—19日和2021年3月24—26日測定了紅花、小黃金、臺農(nóng)3個品種花粉活力，兩個時段均為盛花期。從表2可知，2021年3月平均最高溫度31.6 ℃，較2020年12月的平均最高溫度22.2 ℃高9.4 ℃，而2021年3月平均最低溫度也較2020年12月高4.7 ℃，兩個月份的氣溫相差較大。紅花西番蓮2021年3月的花粉活性與2020年12月差異明顯，2020年12月10：00至16：00左右活性花粉比例一直保持在85%以上，比2021年3月測定時間點的活性花粉比例都高。2021年3月，紅花活性花粉比例在15：17便出現(xiàn)了急劇下降，而2020年12月的活性花粉比例在16：13仍保持87.02%。說明2020年12月紅花西番蓮花粉活力較2021年3月高。小黃金1號花粉活力在2021年春季和2020年冬季相鄰時間段差異不明顯；2021年春季的臺農(nóng)花粉活力稍高于2020年冬季，這反映了不同品種西番蓮的花粉活力對溫度變化的敏感性不同。

表2 不同季節(jié)不同品種西番蓮花粉活力比較

2020年12月19日分別取簡易網(wǎng)室和露地種植的紅花西番蓮測定花粉活力，由圖7可知，露地種植的各時間點活性花粉比例均比網(wǎng)室種植高；露地種植的活性花粉比例80%左右，而網(wǎng)室種植的活性花粉比例70%及以下。網(wǎng)室種植的活性花粉比例呈現(xiàn)先降后升的趨勢，9：00活性花粉比例最低，為62.28%，10：30達到最大，為70.01%；露地種植的活性花粉比例變化趨勢一致，與網(wǎng)室不同的是出現(xiàn)了第二次下降的拐點，9：30活性花粉比列最低，為78.89%，8：30和10：00較高，分別為85.03%和85.01%。

圖7 不同種植環(huán)境下紅花西番蓮活性花粉變化

3 結(jié)論與討論

自然條件下，西番蓮花粉壽命極短，常在花后第二天便失去活力，因而花粉采集與貯藏顯得尤為重要。確定花粉最佳采集時期，保證花粉最佳成熟度，是決定貯藏花粉活力保持較高水平以及后續(xù)雜交育種成功的關(guān)鍵[11]。供試6個品種中，除紫花西番蓮?fù)?，其他品種花粉活力均在花朵完全開放前后達到峰值，這就是花粉采集最佳時間。小黃金1號和大黃金1號活性花粉比例最高可達90%以上，分別為94.96%和95.51%。不同品種西番蓮花粉發(fā)育進程不同，其活力的持續(xù)時間也不同。小黃金1號和臺農(nóng)花粉活力持續(xù)時間最長，08：00—17：00之間均保持80%以上的高活力，活性花粉比例80%以上的其他品種持續(xù)時間分別是大黃金1號6 h，滿天星3 h，紅花僅1 h。對于紅花西番蓮而言，適當?shù)蜏赜欣谄浔３州^高的花粉活力；另外，露地種植環(huán)境下其花粉活力明顯高于網(wǎng)室種植。

花粉活力主要受遺傳因素影響，環(huán)境溫度和相對濕度也是影響花粉活力的重要因子[12-13]。李鳳榮[14]等指出，植物花粉在低溫條件下可以保持較高的活力。本研究中，紅花西番蓮花粉活力2020年冬季明顯比2021年春季高，而且活力持續(xù)時間更長，這與前人的研究結(jié)果一致；小黃金1號在這兩個季節(jié)花粉活力未出現(xiàn)明顯差異；臺農(nóng)2021年春季的花粉活力比2020年冬季略高，但差異不明顯。這說明不同溫度對不同品種西番蓮花粉活力影響不同。此外，露地種植與網(wǎng)室種植的紅花西番蓮花粉活力差異明顯，露地種植溫度低、濕度高，網(wǎng)室種植溫度高、濕度低，光照強度也不相同，這些可能是影響花粉活力不同的主要因素；也可能由于長期的露地種植使紅花西番蓮產(chǎn)生較強的抗逆能力，使其具有保持較高花粉活力的能力，有待于進一步研究。

本研究對當前西番蓮主栽品種和觀賞品種花粉收集時間和田間授粉實踐有一定的參考價值；對不同季節(jié)花粉活力進行了比較，但花粉取自同朵花單個花藥，同朵花中不同花藥的花粉發(fā)育程度理論上最為相似，但每一批次開放的花朵個體間存在差異，營養(yǎng)條件也會影響花藥發(fā)育質(zhì)量，有待進一步驗證。下一步研究中，將采集相同生育時期不同花朵花粉混合后測定，一方面增強花粉的代表性，另一方面增加測定時間點，增加至8～10個時間點，更好地探索部分材料出現(xiàn)二次拐點的原因。對于一些品種，如紫花西番蓮在花朵開放當天花粉活力極低，花朵開放前后1 d甚至更長時間會出現(xiàn)活力峰值可作為今后研究方向。