王夢(mèng)花，林小仙，琚萌萌，陰佳璐，王東亮*，王姝麒*

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.北京小仙燉生物科技有限公司,北京 100020;3.河北省燕窩鮮燉技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 廊坊 065700)

唾液酸是含9個(gè)碳的α-酮酸，因其存在的位置和形式不同，唾液酸具有多種活性。位于大腦中的唾液酸，對(duì)大腦的發(fā)育中起著重要的作用，能夠提高記憶力和促進(jìn)腦部發(fā)育，唾液酸在細(xì)胞保護(hù)、免疫、抗病毒和抗腫瘤等過程中也發(fā)揮著重要作用。唾液酸的主要來源有母乳、乳制品和燕窩，其中燕窩的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值巨大，是食物中唾液酸的主要來源。近5年來對(duì)燕窩的研究大多與唾液酸有關(guān)，燕窩中的唾液酸主要以結(jié)合態(tài)存在，游離態(tài)僅占2%左右[1]，結(jié)合態(tài)的唾液酸即唾液酸與細(xì)胞表面復(fù)雜的多糖結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮作用。唾液酸的制備方法很多，其中微生物發(fā)酵和全細(xì)胞合成制備唾液酸用到的原料便宜、能源消耗低且對(duì)環(huán)境影響小。本文研究并總結(jié)了唾液酸的來源、制備方法、檢測(cè)方法以及其生物活性，對(duì)進(jìn)一步的針對(duì)唾液酸的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)和參考。

1 唾液酸的來源

唾液酸，又稱為神經(jīng)氨酸，通常由不同的糖苷鍵(α-2,3-、α-2,6-、α-2,8-或α-2,9-)[2]連接在糖蛋白和糖脂的非還原端。唾液酸家族現(xiàn)已超50種以上化合物，其中N-乙酰基神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)這兩種最為豐富和重要(結(jié)構(gòu)圖見圖1)。N-乙酰基神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)不僅是人體中的內(nèi)源性唾液酸，還是神經(jīng)系統(tǒng)不可或缺的結(jié)構(gòu)和功能成分[3]。唾液酸最早由Blix等[4]采用弱酸水解的方法從牛的唾液腺粘蛋白中提取分離得到。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌中都可以發(fā)現(xiàn)唾液酸的存在，隨著生物進(jìn)化程度的增加，唾液酸的種類和含量也在增加，如人類及其他哺乳動(dòng)物等高等動(dòng)物體內(nèi)的唾液酸含量要高于低等動(dòng)物[5]。唾液酸的食物來源主要是燕窩、母乳、乳制品和雞蛋。研究表明，唾液酸在雞蛋和牛奶中的含量分別為0.07%和0.01%[6]。母乳和燕窩中的唾液酸含量很高，Wang等[7]測(cè)得母乳初乳中的唾液酸含量可高達(dá)2 201.4 mg·L-1，Huang等[8]用高效液相色譜法測(cè)定了馬來西亞和印度尼西亞所產(chǎn)燕窩中的唾液酸的含量，含量均在10%左右。

圖1 唾液酸的結(jié)構(gòu)

2 唾液酸的制備

唾液酸的制備方法主要包括天然產(chǎn)物提取、化學(xué)法與酶法合成、微生物發(fā)酵法、全細(xì)胞合成。天然產(chǎn)物中唾液酸的含量較低，不易進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。化學(xué)法與酶法合成結(jié)合使用要求酶是純化的，制備過程較煩瑣。微生物發(fā)酵和全細(xì)胞合成與其他方法相比具有環(huán)境友好性、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，相比微生物發(fā)酵法，全細(xì)胞合成縮短了生產(chǎn)周期，提高了底物轉(zhuǎn)化率，降低了能耗。

2.1 天然產(chǎn)物提取 天然產(chǎn)物提取是從含有唾液酸的天然資源中提取唾液酸，如燕窩、禽蛋、雞蛋、茄子、牛奶，常用的提取方法有水提法、酸提法和酶提法。20世紀(jì)70年代Martin等[9]用熱水在燕窩中提取到了唾液酸，Wong等[10]使用鹽酸模擬胃液將燕窩中的糖蛋白水解成較小的肽，N-乙酰神經(jīng)氨酸從其結(jié)合形式中釋放出來。酸法提取的過程中產(chǎn)物容易發(fā)生降解，酶法提取相對(duì)溫和，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，因此研究者嘗試用唾液酸酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)唾液酸進(jìn)行提取。陳昕露[11]用木瓜蛋白酶提取燕窩中的唾液酸，并對(duì)其加工條件進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)物提取率較傳統(tǒng)水提法提高了38.58%。李敬等[12]采用超聲輔助酶法提取燕窩中的唾液酸，用響應(yīng)面法優(yōu)化燕窩唾液酸的提取工藝，在最佳優(yōu)化工藝參數(shù)下，測(cè)得燕窩唾液酸的提取率為84.76%。由于天然產(chǎn)物中唾液酸的含量較低，分離純化的過程比較復(fù)雜，回收率低，因此不易進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 化學(xué)法與酶法合成 唾液酸的化學(xué)合成法第一步N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)與二叔丁基氧代丁二酸的鉀鹽進(jìn)行縮合，第二步堿的催化下脫羧，生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。此方法不僅需要高溫、高壓這些苛刻的條件，且催化劑銦有毒，產(chǎn)物后處理也非常的復(fù)雜且收益較低，因此不能滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。酶法合成通常用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NanA)催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)生產(chǎn)唾液酸，其缺點(diǎn)就是底物價(jià)格較貴。在實(shí)際應(yīng)用中化學(xué)合成與酶合成法一般結(jié)合使用[13]。Hu等[14]使用親和色譜法純化了大腸桿菌中的N-乙酰差向異構(gòu)酶(AGE)和NanA，將這兩種酶固定化在樹脂上，在反應(yīng)器中將N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)為唾液酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了73%。

2.3 微生物發(fā)酵法 與化學(xué)法以及酶法合成相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)唾液酸具有環(huán)境友好性，能源消耗低，不需要添加酶，工藝操作簡(jiǎn)單，原料易得等優(yōu)點(diǎn)。但是微生物發(fā)酵法具有產(chǎn)物濃度低，且常伴有副產(chǎn)物的缺點(diǎn)，可以通過減少分解代謝、改變合成途徑和平衡前體物的供應(yīng)來提高其產(chǎn)率[15]。由于合成唾液酸的細(xì)菌大多是致病菌，因?yàn)榇竽c桿菌是生物安全的，且其代謝工程遺傳工具系統(tǒng)功能強(qiáng)大，且發(fā)酵工藝成本低[16]，所以常被作為合適的細(xì)菌合成唾液酸。過去主要在發(fā)酵罐中生產(chǎn)唾液酸，de Vries等[17]用大腸桿菌在一次性袋式反應(yīng)器中生產(chǎn)聚唾液酸，改善了發(fā)酵工藝，其濃度達(dá)到了245 mg·L-1。隨著對(duì)發(fā)酵機(jī)制和代謝工程深入研究，研究人員通過調(diào)節(jié)唾液酸的生物合成途徑來提高產(chǎn)率，如Chen等[18]通過敲除編碼NanA的基因，過量表達(dá)唾液酸胞苷單磷酸酯合成酶(NeuA)、N-乙酰神經(jīng)氨酸7-O-乙?；D(zhuǎn)移酶(NeuD)和聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NeuS)，構(gòu)建了高效的重組大腸桿菌菌株，減少了唾液酸的分解代謝，聚唾液酸的產(chǎn)量提高了85%?？莶菅挎邨U菌也可發(fā)酵生產(chǎn)聚唾液酸，李思杰等[19]優(yōu)化了Pholin啟動(dòng)子，構(gòu)建質(zhì)粒具有能夠編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NeuB)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶(NeuC)的基因，在枯草芽孢桿菌中生產(chǎn)唾液酸，其產(chǎn)量達(dá)到了0.226 g·L-1。Zhang等[20]對(duì)枯草芽孢桿菌中合成唾液酸的3條途徑的關(guān)鍵酶的來源進(jìn)行了比較和優(yōu)化，并對(duì)這些途徑進(jìn)行了組合和優(yōu)化，分批補(bǔ)料進(jìn)行發(fā)酵，唾液酸的產(chǎn)量達(dá)到了30.10 g·L-1，且這一方法不需要構(gòu)建質(zhì)粒。Zhang等[21]用模塊化路徑工程對(duì)N-乙酰葡萄糖胺和磷酸烯醇式丙酮酸的供應(yīng)進(jìn)行了平衡，唾液酸在枯草芽孢桿菌中的產(chǎn)率提高了5倍。

2.4 全細(xì)胞合成 全細(xì)胞合成是介于酶法合成和微生物發(fā)酵中間的一種合成方法，與酶法合成相比，全細(xì)胞合成過程相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要純化的酶，降低了成本。以往通常用兩種不同的宿主偶聯(lián)生產(chǎn)唾液酸。Tao等[22]構(gòu)建了大腸桿菌的突變體，將AGE和NanA催化的兩個(gè)反應(yīng)包裝在突變體的單細(xì)胞中，安全的溫度誘導(dǎo)載體降低了副反應(yīng)和傳質(zhì)阻力，生物轉(zhuǎn)化效率比偶聯(lián)細(xì)胞生產(chǎn)高10倍。Gao等[23]從人腸道中的多形擬桿菌屬中鑒定了一個(gè)編碼AGE的基因BT0453，構(gòu)建了能表達(dá)AGE和NanA的大腸桿菌生產(chǎn)唾液酸，產(chǎn)率可高達(dá)53.6%。丙酮酸在相關(guān)酶的催化下能生成副產(chǎn)物乙偶姻，Zhao等[24]優(yōu)化了控制AGE和NanA的啟動(dòng)子，敲除編碼乙酰乳酸合成酶的基因alsS和編碼乙酰乳酸脫羧酶的基因alsD，丙酮酸的副產(chǎn)物減少，原料增加，相應(yīng)的GlcNAc的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到了55.57%，這同時(shí)也證明了枯草芽孢桿菌和大腸桿菌一樣是可以生產(chǎn)唾液酸的全細(xì)胞催化劑。

3 唾液酸的檢測(cè)方法

高效液相色譜法是檢測(cè)唾液酸最常用的方法，常與不同的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合來檢測(cè)衍生化的唾液酸，其靈敏度和準(zhǔn)確性較高。相比高效液相色譜法，傳感器檢測(cè)法一般不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，具有選擇性強(qiáng)和檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)。

3.1 高效液相色譜法 高效液相色譜一般與不同的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合來檢測(cè)唾液酸，HPLC-MS具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)，但由于昂貴的試劑和難以獲得穩(wěn)定的衍生分子，阻礙了該方法應(yīng)用。王天嬌等[25]應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法來檢測(cè)人血清中的唾液酸，并測(cè)得回收率為87.9%～100.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%～3.0%，此方法的回收率、重現(xiàn)性、靈敏度均很好，對(duì)于定性或定量檢測(cè)血清中唾液酸的含量非常有效。徐柳柳等[26]用4,5-亞甲二氧基-1,2鄰苯二胺鹽(DMB)試劑衍生化唾液酸，利用液相-熒光檢測(cè)器檢測(cè)酸奶中的唾液酸含量，克服了雜質(zhì)干擾，靈敏度也較高。Li等[27]通過使用吉拉德試劑P對(duì)唾液酸進(jìn)行衍生化，在電噴霧正離子模式下的選擇性離子檢測(cè)對(duì)唾液酸進(jìn)行定量分析，此方法靈敏高、穩(wěn)定且通用，滿足了游離唾液酸(FSA)和總唾液酸(TSA)檢測(cè)的臨床需要。

3.2 傳感器檢測(cè)法 傳感器檢測(cè)法之前研究的傳感器大多數(shù)是酶生物傳感器，由于酶的活性具有易發(fā)生變化、不穩(wěn)定、成本比較高等缺點(diǎn)，研究者開始致力于尋找更加穩(wěn)定、簡(jiǎn)單、靈敏的傳感器，目前比色傳感器、分子印跡傳感器、熒光傳感器、電化學(xué)傳感器都廣泛用于唾液酸的檢測(cè)。

電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的靈敏很高，但易受環(huán)境、儀器波動(dòng)的干擾，為了解決這一問題，有研究者提出了電化學(xué)發(fā)光比率傳感器的策略，Cao等[28]首次提出以Ru(bpy)32+摻雜二氧化鈦納米粒子[TiO2-Ru(bpy)32+NPs]和聚乙烯亞胺(PEI)修飾的硫化鎘(CdS)量子點(diǎn)(PEI-CdS QDS)作為電化學(xué)發(fā)光單元，分子印跡聚合物(MIP)作為識(shí)別元件，得到了一種高性能的抗干擾的電化學(xué)發(fā)光比率傳感器。唾液酸中含有一個(gè)甘油側(cè)鏈，硼酸可以與甘油側(cè)鏈中的二醇結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)。Chen等[29]用有機(jī)電化學(xué)晶體管作為傳感平臺(tái)，該晶體管有漏極、源極、柵極三個(gè)電極，柵電極用羧基化的多壁碳納米管修飾，共價(jià)結(jié)合3-氨基苯硼酸，3-氨基苯硼酸特異性識(shí)別唾液酸，從而使柵電極的電壓發(fā)生改變，在0.1～7 mmol·L-1范圍內(nèi)非常靈敏，且非常便捷，這種基于晶體管的生物傳感器在唾液酸的檢測(cè)中具有潛在的巨大價(jià)值。

熒光法測(cè)定唾液酸，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Yu等[30]設(shè)計(jì)并合成了一種新的有機(jī)金屬框架UiO-66-NH2@B(OH)2，UiO-66-NH2@B(OH)2中的硼酸官能團(tuán)識(shí)別唾液酸，使其熒光減弱甚至淬滅，通過小鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此法的檢出限低至0.025 mmol·L-1，線性范圍為0.05～2.5 mmol·L-1，具有靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。

4 唾液酸的生物活性

唾液酸的生物活性主要與其存在的形式和位置有關(guān)。細(xì)胞表面的唾液酸具有介導(dǎo)免疫黏附、細(xì)胞識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)等作用，生物體內(nèi)的唾液酸具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、促進(jìn)腦部發(fā)育等作用。

4.1 促進(jìn)腦部發(fā)育和提高記憶力 腦組織的中唾液酸含量比身體其他組織都要高，大腦組織中70%結(jié)合態(tài)唾液酸以神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在[31]，神經(jīng)節(jié)苷脂是一種酸性鞘糖脂，參與突觸的形成和神經(jīng)的傳遞，而記憶力形成結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是穩(wěn)定的突觸連接[32]，有研究證明缺乏了唾液酸的嬰兒出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)育遲緩[33]，Xie等[34]發(fā)現(xiàn)在妊娠期或哺乳期給予母鼠燕窩(EBN)，可以改善其后代的學(xué)習(xí)和記憶功能，表明了唾液酸在神經(jīng)元發(fā)育中的作用。有研究表明在哺乳期提供唾液酸和唾液酸化寡糖，可以增強(qiáng)大鼠的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用(LTP)和改善大鼠的記憶力[35]。唾液酸還可以與其他藥物協(xié)同使用治療神經(jīng)疾病，如成亞渝等把更昔洛韋和單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)聯(lián)合起來治療疾病，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著減輕病毒性腦炎伴精神行為異常患兒的癥狀，提高患者的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的水平，這都證實(shí)了唾液酸起著促進(jìn)腦部發(fā)育和提高記憶力的作用[36]。

帕金森是一種神經(jīng)退行性疾病，臨床研究表明GM1可用于治療帕金森[37]，為了探討其治療機(jī)制，蔣暐卿等[38]將魚藤酮注射到小鼠中，誘導(dǎo)其產(chǎn)生帕金森，進(jìn)而對(duì)GM1的治療機(jī)制研究，最終證實(shí)GM1能保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，減緩帕金森大鼠的行為學(xué)改變。Careena等[39]通過實(shí)驗(yàn)證明燕窩提取物可以對(duì)抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，并逆轉(zhuǎn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)損害，因此燕窩可以作為預(yù)防帕金森的一種食物。

4.2 抗病毒 唾液酸不僅是細(xì)菌的受體，還是病毒的常見的受體，由此可以通過對(duì)唾液酸進(jìn)行研究探尋抗病毒的新方法。病毒包膜主要由血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種物質(zhì)組成，血凝素與唾液酸受體結(jié)合，病毒在靶細(xì)胞中進(jìn)行增殖，通過神經(jīng)氨酸酶裂解唾液酸殘基，使病毒從宿主細(xì)胞中釋放出去，因此可以靶向宿主唾液酸和靶向病毒與受體結(jié)合的區(qū)域來抗病毒。DAS-181通過裂解宿主細(xì)胞上的唾液酸來抑制宿主細(xì)胞和病毒的結(jié)合，Danziger-Isakov等[40]用DAS-181成功治療了2019年冠狀病毒繼發(fā)性呼吸窘迫的10個(gè)月大的嬰兒。有研究用一種小分子化合物CM9與血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白相互作用，改變?nèi)诤系鞍?F)的構(gòu)象，能夠使病毒感染受阻[41]。Eveno等[42]用唾液酸的衍生物BCX-2798作為抑制劑與HN蛋白的關(guān)鍵成分共價(jià)結(jié)合，有效地抑制了病毒的復(fù)制。唾液酸的功能與酶的作用密切相關(guān)，乙酰化是神經(jīng)氨酸最常見的修飾，Huang等[43]發(fā)現(xiàn)人類冠狀病毒(hCoV-HKU1)的決定受體是9-O-乙?；僖核?，hCoV-HKU1能夠編碼蛋白血凝素酯酶蛋白(HE)，HE主要作為冠狀病毒的受體破壞酶(RDE)促進(jìn)病毒子代釋放。唾液酸酶抑制劑的抗病毒作用在抗流感病毒領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，因?yàn)橥僖核崦傅幕钚允菑乃拗骷?xì)胞上釋放新形成的病毒所必需的，抑制該酶可以阻止病毒感染的傳播，奧司他韋是該酶的常見抑制劑，Zhao等[44]設(shè)計(jì)了一種酰腙類神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其IC50要低于奧司他韋。

燕窩是唾液酸的主要食物來源。Guo等[45]的研究表明燕窩提取物可以抑制流感病毒的感染。Haghani等[46]研究燕窩抗流感病毒的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)燕窩可促進(jìn)溶酶體的降解、減少自噬小體的積累，從而有效地減少甲型流感病毒的復(fù)制，且活性與唾液酸的含量正相關(guān)。

4.3 抗炎 近年來對(duì)唾液酸的研究主要集中在抗腫瘤功能和神經(jīng)發(fā)育功能，對(duì)抗炎的功能研究較少。陳斯瑋等[47]的研究發(fā)現(xiàn)唾液酸能夠提高小鼠的免疫功能，且與劑量成正相關(guān)。白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)在炎癥和免疫中均起主要作用，具有抗炎的特性，Payazdan等[48]通過研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸可以增強(qiáng)IL-4和IL-10基因的表達(dá)，IL-4和IL-10增多，抗炎作用增強(qiáng)。劉偉等[49]通過研究也發(fā)現(xiàn)唾液酸能夠降低白介素-6、腫瘤壞死因子等致炎因子的釋放，增加前列腺素E2釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。唾液酸的濃度還可用來區(qū)分炎癥的類別，Gruszewska等[50]的研究表明可以通過測(cè)定總唾液酸的濃度來區(qū)分慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。

4.4 抗腫瘤 唾液酸在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，因此唾液酸可以作為腫瘤標(biāo)志物來診斷腫瘤，有助于腫瘤的治療。Achalli等[51]通過研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，口腔癌患者的血清和唾液中的唾液酸的平均水平顯著增加，因此血清和唾液中的唾液酸可作為生物標(biāo)志物來診斷口腔癌。Li等[52]開發(fā)了一種新的試劑盒，可以同時(shí)檢測(cè)血清中唾液酸和羥脯氨酸的濃度，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物人附睪蛋白4和碳水化合物抗原125相比，唾液酸和羥脯氨酸的聯(lián)合檢測(cè)具有更高的診斷價(jià)值，可用于卵巢癌的診斷和動(dòng)態(tài)檢測(cè)。

5 總結(jié)

唾液酸的來源廣泛，可通過天然產(chǎn)物提取、微生物發(fā)酵、全細(xì)胞合成、化學(xué)法和酶法合成制備。微生物發(fā)酵和全細(xì)胞合成具有環(huán)境友好性、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，一些合理的設(shè)計(jì)方法(改變合成路徑，減少分解代謝、基因重組)都可以提高其產(chǎn)量，是兩種非常具有研究前景的制備技術(shù)。檢測(cè)唾液酸最常用的方法是高效液相色譜法，相比高效液相色譜法，傳感器檢測(cè)法一般不需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，且檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高。唾液酸具有多種生物活性，如促進(jìn)腦部發(fā)育、抗炎、抗病毒、抗腫瘤。未來的研究可能集中于探索唾液酸的新的生理功能以及其作用機(jī)制，并需要開發(fā)新的分析方法來探索其作用。隨著分析方法和合成方法的不斷完善、生理功能的不斷發(fā)現(xiàn)，唾液酸在未來會(huì)更好地造福人類。