蔣 鋒，梁日朗，閆 艷，梁澤恩，黃正剛，劉鵬飛

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室，廣東 廣州 510225）

【研究意義】甜玉米是普通玉米籽粒在淀粉合成代謝途徑中1 個或幾個基因發(fā)生突變，造成淀粉合成受阻，蔗糖等糖類物質(zhì)積累而形成的特用玉米類型［1］。甜玉米營養(yǎng)豐富、適口性好、經(jīng)濟效益高，深受廣大消費者喜愛。甜玉米果皮由不可消化的纖維素、多糖等組成，果皮厚度是影響甜玉米口感的重要因素，也是評價甜玉米品質(zhì)的重要指標(biāo)［2］。研究果皮厚度性狀的遺傳規(guī)律，準(zhǔn)確定位甜玉米果皮厚度的QTL，對挖掘利用果皮薄的甜玉米種質(zhì)資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，甜玉米的果皮厚度與采收期相關(guān)［3］。樂素菊等［4］研究玉米果皮的結(jié)構(gòu)，表明果皮較薄的玉米材料果皮細(xì)胞層數(shù)較少，果皮細(xì)胞壁木質(zhì)化程度較低。趙婕等［5］以玉米果皮的穿刺強度作為果皮柔嫩度的評價標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)果皮穿刺強度與果皮細(xì)胞層數(shù)以及果皮纖維素含量呈正相關(guān)，玉米果皮細(xì)胞的構(gòu)造會影響果皮厚度。果皮厚度與遺傳背景十分相關(guān)，并且具有較高的遺傳力［6］。王曉明等［7］研究指出，加性-顯性模型適用于超甜玉米的果皮厚度遺傳，至少有3 對以上的基因控制果皮厚度，狹義遺傳力29.6%。常大軍等［8］指出，玉米的果皮厚度符合加性遺傳模型。Wang 等［9］應(yīng)用PFLP 標(biāo)記技術(shù)，利用重組自交系（RIL）群體進(jìn)行果皮厚度分析，在玉米的第1、2、6 號染色體上檢測出與之相關(guān)的QTL。胡沖［［10］同樣以糯玉米RIL 群體作為試驗材料，定位到5 個與果皮厚度以及粒長有關(guān)的QTL，分別分布在第1、4、7、8、9 染色體上，其中4 個是主效QTLs，能在不同環(huán)境條件中穩(wěn)定表達(dá)。于永濤等［11］以兩個果皮厚度差異顯著的材料的190 個BC2F2家系為作圖群體，分別采用基于復(fù)合區(qū)間作圖（CIM）和基于混合線性CIM模型（MCIM）兩種遺傳模型檢測QTL，分別定位到3 個和5 個QTL 與果皮厚度相關(guān)。Choe 等［12］對韓國糯玉米種質(zhì)果皮厚度進(jìn)行QTL 檢測，共定位到7 個QTL，檢測到的QTL 之間不存在上位性互作效應(yīng)。Park 等［13］在糯玉米第4、5、8、9 染色體上定位到與果皮厚度性狀相關(guān)的QTL?！颈狙芯壳腥朦c】針對甜玉米果皮厚度的遺傳規(guī)律及QTL 挖掘研究仍不充分，本試驗以甜玉米自交系T77 和T15 作為親本配制雜交組合，利用主基因+多基因混合遺傳模型分析方法對甜玉米果皮厚度進(jìn)行遺傳模型分析，利用SSR 分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，結(jié)合F2群體的果皮厚度，應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法對甜玉米果皮厚度進(jìn)行QTL 定位?！緮M解決關(guān)鍵問題】對甜玉米果皮厚度進(jìn)行遺傳分析及相關(guān)QTL 定位，確定其遺傳規(guī)律，找到與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為分子輔助選擇果皮薄的甜玉米、創(chuàng)新甜玉米種質(zhì)資源、選育優(yōu)質(zhì)新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗親本材料為果皮厚度有顯著差異的2 個甜玉米自交系T77 和T15，分別是以泰國甜玉米品種先甜5 號和中國臺灣甜玉米品種華珍為基礎(chǔ)材料，經(jīng)8 代自交、鑒定選育而成的sh2 型甜玉米，T77 果皮厚度為64.17（±0.35）μm，T15 果皮厚度為81.96（±0.37）μm。

主要試劑：Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒及其他生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要儀器：GENETEST 系列基因擴增儀（杭州柏恒科技有限公司）、高速離心機（Thermo Fisher SCIENTIFIC，德國）、Nano-300 微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）、電泳儀（DYY-6C 型，北京市六一儀器廠）、GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD,美國）。

1.2 試驗方法

親本材料（自交系T77 和T15）在廣州市番禺區(qū)仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院科研教學(xué)基地進(jìn)行田間種植與組合配制，雙行壟作，行距60 cm，株距30 cm，行長約5 m，四周設(shè)立保護(hù)行防止串粉。2019 年3—6 月，利用T77（♀）和T15（♂）配制雜交組合得到F1代雜交種子，9—12 月F1種植并自交，收獲得到F2種子；2020 年3—6 月，分別種植2 個親本各20 株，以及來自同一果穗上的216 個F2單株，從F2中選出200 株發(fā)育良好的果穗并套袋自交，于苗期對群體單株葉片采樣，提取基因組總DNA 進(jìn)行基因型分析，于采收期測量各單株果皮厚度表型。

1.3 測定項目及方法

1.3.1果皮厚度測定 將采收的鮮果穗，使用鑷子取中間的10 粒籽粒用于測量。利用鑷子與刀片分離籽粒頂部果皮，參照劉鵬飛等［14］的方法測量果皮厚度，每粒籽粒重復(fù)測量3 次，取其平均值作為甜玉米果皮厚度的最后觀測值。

1.3.2DNA 提取和基因型分析 利用Paterson等［15］的方法提取F2群體玉米葉片DNA。參照Wang 等［9］的方法，從中選取800 對多態(tài)性高的SSR 引物，結(jié)合前人研究的玉米連鎖遺傳圖譜［16-18］，再結(jié)合玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.maizegdb.org）篩選出174 對在親本T15 和T77 之間有多態(tài)性的引物，參照張姿麗等［19］方法PCR擴增以及聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定F2中每個單株的基因型。

使用Microsoft Excel 2010 對F2群體果皮厚度數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用數(shù)據(jù)調(diào)用函數(shù)列出數(shù)據(jù)頻率分布表，參照蓋鈞鎰［20］、王建康等［21］和章元明等［22］的方法計算各遺傳模型的最大似然函數(shù)值以及AIC 值，選出備選模型，比較各備選模型的5 個適應(yīng)性參數(shù)（U12、U22、U32、nW2、Dn）值，進(jìn)一步確定最佳模型。利用最小二乘法估算一階遺傳參數(shù)和二階遺傳參數(shù)。

1.3.3數(shù)據(jù)處理及QTL 檢測 借助JoinMap3.0 軟件分析各個標(biāo)記之間是否存在連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜［23］。利用Windows QTL Cartographer 2.5軟件程序結(jié)合復(fù)合區(qū)間作圖法，在F2群體中檢測果皮厚度的QTL［24］。在通過1 000 次LOD 值隨機抽樣確定其閾值（LOD＞2.5）。結(jié)合以上兩個軟件及F2群體果皮厚度表型數(shù)據(jù)，在構(gòu)建的連鎖圖區(qū)域掃描與果皮厚度相關(guān)的QTL 位點，計算并得到LOD 值、加性效應(yīng)值以及每個QTL 的表型貢獻(xiàn)率。

QTL 命名方法參照McCouch 等［25］的命名規(guī)則，并按照一定的規(guī)律格式命名，即QTL+性狀+染色體+QTL 個數(shù)，其中小寫“q”作為QTL 的開始，英文縮寫代表測定的性狀，即PT（Pericarp Thickness）代表果皮厚度；用“1、2、3”區(qū)別不同染色體上QTL 位點的順序命名。

2 結(jié)果和分析

2.1 甜玉米F2 群體果皮厚度頻數(shù)分布及正態(tài)分布

200 個甜玉米F2的果皮厚度平均值73.91 μm，變幅為61.23～84.76 μm，標(biāo)準(zhǔn)差4.84 μm，變異系數(shù)為6.54%，峰度、偏度分別為-0.41 和-0.16。根據(jù)變幅和變異系數(shù)可知，測定的甜玉米果皮厚度性狀差異不顯著，峰度及偏度的絕對值較小，未顯著偏離正態(tài)分布，可進(jìn)一步進(jìn)行遺傳分析和QTL 定位，并對F2的果皮厚度進(jìn)行正態(tài)分布檢驗（圖1）。

圖1 A-1 模型 T77×T15 組合F2 果皮厚度的頻數(shù)分布Fig.1 Distribution of pericarp thickness in F2 population of cross combination T77×T15 under A-1 genetic model

2.2 果皮厚度的遺傳模型分析

利用F2果皮厚度的數(shù)據(jù)頻率分布表，使用植物數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳模型求出11個模型的極大似然值，利用極大似然值函數(shù)求出相應(yīng)的AIC 值（表1）。當(dāng)模型的AIC 值最小時，說明該模型觀測值的估計概率分布與真實分布的擬合程度最高，即為備選的遺傳模型；當(dāng)多個模型的AIC 值比較接近時，則可以有幾個備選模型。由表1 可知，模型A-1 的AIC 值最小，同時A-0、B-3 和B-6 的AIC 值與A-1 十分接近，因此A-1、A-0、B-3、B-6 可作為備選模型。

表1 雜交組合T15×T77的F2 的11種備選遺傳模型的極大似然函數(shù)值和AIC值Table 1 Max-likelihood-value (MLV) and AIC values of eleven candidategeneticmodels for F2 ofcrossco mbinationT15×T77

2.3 備選遺傳模型的適合性檢驗

由表2 可知，4 個備選模型A-1、A-0、B-3、B-6 的U12、U22、U32（均勻性檢驗）均大于0.05，表示為不顯著；Dn（Kolmogorov 檢驗）值也未達(dá)到顯著水平；nW2（Smirnov 檢驗）表明4 個備選模型均不顯著。由于A-1 模型AIC 值最小，因此可以得出甜玉米果皮厚度的最優(yōu)模型是A-1，即表現(xiàn)為1 對加性-顯性主基因遺傳。

表2 果皮厚度備選遺傳模型的適合性檢驗Table 2 Test for suitability of candidate genetic models for pericarp thickness

對遺傳模型A-1 下成分（基因型）分布均值M、標(biāo)準(zhǔn)差SD 以及分布權(quán)重W 進(jìn)行分析，由表3 的分布權(quán)重可知，F(xiàn)2的3 種成分分布比例為1 ∶2 ∶1，與理論分布比例一致。

表3 最適模型A-1 下F2 成分的分布均值、分布標(biāo)準(zhǔn)差和分布權(quán)重Table 3 Mean (M),standard deviation (SD) and weight of distribution (W) of F2 components under the optimal model A-1

2.4 甜玉米果皮厚度遺傳模型的遺傳參數(shù)估計

根據(jù)已確定的果皮厚度最優(yōu)模型和IECM 估算方法［1］，對F2群體的果皮厚度性狀進(jìn)行遺傳參數(shù)估計?？傮w均值m為73.55，主基因的加性效應(yīng)d為-5.67，顯性效應(yīng)h為0.67，表型方差σ2P為23.40，遺傳方差σ2mg為16.17，遺傳率h2mg為69.10%，主基因遺傳率較高。

2.5 甜玉米果皮厚度的標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建

從800 對SSR 引物中篩選出174 對在親本T15 和T77 之間有多態(tài)性的引物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行χ2測驗，最后選出169 對符合1 ∶2 ∶1 分離比的引物。利用Joinmap3.0 軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)，對多態(tài)性位點進(jìn)行遺傳連鎖關(guān)系分析，得到SSR 標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，其中包括151 個位點分布于玉米10 條染色體上，圖譜總長度為1 270 cM（圖2）。

圖2 甜玉米T15×T77 組合F2 群體SSR 標(biāo)記連鎖遺傳圖譜分布Fig.2 Distribution of SSR linkage genetic map for sweet corn pericarp thickness in F2 population of cross combination T15×T77

2.6 甜玉米果皮厚度QTL 定位

由表4 可知，檢測到3 個甜玉米果皮厚度相關(guān)基因的QTL，其中qPT-ch.5-1和qPT-ch.5-2位于第5 染色體上，qPT-ch.8-1位于第8 染色體上。qPT-ch.5-1的加性效應(yīng)值為-2.39，顯性效應(yīng)值為0.17，位于bin5.04 區(qū)域，可以解釋12.07%的表型變異，標(biāo)記區(qū)間是bnlg150～bnlg653；qPT-ch.5-2的加性效應(yīng)值為-3.01，顯性效應(yīng)值為0.27，同樣位于bin5.04 區(qū)域，標(biāo)記落在bnlg653～bnlg1208 之間，表型貢獻(xiàn)率14.68%；第8 染色體上檢測到的果皮厚度QTL（qPT-ch.8-1），其加性效應(yīng)值為-3.06，顯性效應(yīng)值為-0.42，位于bin8.03～bin8.04 區(qū)域，標(biāo)記區(qū)間umc1741～bnlg2046，表型貢獻(xiàn)率22.02%。

表4 復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到的果皮厚度QTLTable 4 QTL of pericarp thickness detected by compound interval mapping method

3 討論

目前，植物數(shù)量性狀遺傳的“主基因+多基因遺傳模型”方法已在多種作物中得到應(yīng)用，如小麥［26-28］、水稻［29-30］、花生［31-33］等。這一方法能檢測主基因及其遺傳率，對于育種工作具有重要的指導(dǎo)作用。本研究對甜玉米果皮厚度進(jìn)行主基因+多基因混合遺傳模型分析，結(jié)果表明甜玉米果皮厚度遺傳特點符合“加性-顯性”遺傳模型，與前人的研究結(jié)果［7-8,14］相似。本研究甜玉米果皮厚度的遺傳效應(yīng)不存在上位性互作，與于永濤等［11］研究結(jié)果不同，這可能與不同的試驗材料、種植方式和測量方法有關(guān)。本研究的試驗對象為甜玉米F2群體，下一步需結(jié)合多世代、不同組合進(jìn)行驗證，分析不同遺傳背景下甜玉米果皮厚度的遺傳模型。

研究者曾以果皮重量作為果皮厚度的指標(biāo)，對泰國甜玉米重組自交系群體進(jìn)行QTL 檢測，在第5 號染色體上定位到了與果皮厚度相關(guān)主效QTL［34］。本研究利用SSR 標(biāo)記方法結(jié)合復(fù)合區(qū)間作圖法，在甜玉米的10 條染色體上檢測出3個與果皮厚度相關(guān)的主效QTL，這與前人研究所得的玉米果皮厚度基因數(shù)1.4～5.9 個的結(jié)論相吻合［35］，其中位于第8 染色體的QTL（qPT-ch.8-1）與胡沖等［10］的研究結(jié)果比較接近，可能是同一QTL，結(jié)果有待進(jìn)一步驗證；位于第5 染色體的2 個QTL（qPT-ch.5-1、qPT-ch.5-2）位置較接近，之后可進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位。本研究定位到的QTL 數(shù)目和位置與前人研究不盡相同，可能與試驗材料的遺傳背景、材料之間的遺傳差異、作圖群體、分子標(biāo)記類型以及群體大小等不同有關(guān)。今后可進(jìn)行不同時間、不同地點、不同群體的研究，補充不同環(huán)境條件及不同遺傳背景下甜玉米果皮厚度的遺傳模型及QTL 定位，為甜玉米的種質(zhì)改良及分子輔助選擇提供理論依據(jù)。

本研究以 薄果皮的甜玉米自交系T77 為母本配制雜交組合檢測果皮厚度QTL，檢測到的3個果皮厚度QTL 遺傳效應(yīng)以加性為主且均為負(fù)值，表明降低果皮厚度的QTL 來源于薄果皮的親本T77。在今后的分子育種實踐中，應(yīng)通過輔助選擇薄果皮親本的等位基因?qū)崿F(xiàn)果皮性狀的遺傳改良。

本研究對甜玉米果皮厚度進(jìn)行了初步定位，檢測的QTL 標(biāo)記區(qū)間較大，尚難以有效利用。下一步將結(jié)合玉米基因組序列信息，在主效QTL 標(biāo)記區(qū)間內(nèi)加大分子標(biāo)記密度、擴大群體，找到與QTL 緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期在育種實踐中實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用主基因+多基因遺傳模型方法分析甜玉米果皮厚度的遺傳模型，結(jié)果表明甜玉米的果皮厚度主要受1 對主基因控制遺傳，主基因表現(xiàn)為加性及部分顯性或超顯性，以加性效應(yīng)為主，主基因遺傳率達(dá)69.10%；通過構(gòu)建SSR 分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜與甜玉米F2果皮厚度的測量數(shù)值結(jié)合分析，使用復(fù)合區(qū)間作圖法在甜玉米第5、8 染色體上分別檢測出3 個與果皮厚度相關(guān)的QTL。3 個QTL 的加性效應(yīng)為負(fù)數(shù)，說明對果皮厚度有削弱作用。環(huán)境和微效多基因?qū)τ衩坠ず穸鹊挠绊戄^小，因此育種實踐中應(yīng)重視主基因。檢測出的3 個QTL 的貢獻(xiàn)率均大于10%，屬于主效QTL，在育種實踐時可重點關(guān)注甜玉米染色體上的這3 個QTL 的位置，以此更快對甜玉米的果皮厚度進(jìn)行改良，提高育種的效率。