吳林達，林興奮，黃曉慧，陸鳳珍，梁鈺欣，楊毅紅

（電子科技大學中山學院材料與食品學院，廣東 中山 528400）

【研究意義】細菌纖維素（Bacterial cellulose,BC）是一類由葡萄糖單元通過β-1,-4 糖苷鍵連接組成的高分子聚合物［1］，具有良好的機械強度、吸水性及可生物降解性等優(yōu)點［2］。傳統(tǒng)以椰汁為原料制備細菌纖維素成本較高［3］，因此尋求質優(yōu)價廉的培養(yǎng)原料替代椰汁具有較好的市場前景。新會柑肉作為生產新會陳皮的副產物，通常被大量廢棄從而導致環(huán)境污染，探索以其作為主要原料制備BC 膜，對提高當地農副產品的經濟和環(huán)境效益具有重要意義，同時可為新會廢棄柑肉的資源化利用提供新思路。【前人研究進展】在新會柑肉資源化利用方面，有食品公司利用酵母菌和醋酸菌發(fā)酵柑汁，并制成新會柑酵素等食品［4］，或將新會柑果汁發(fā)酵成飲料［5］，或將柑橘渣作為原料發(fā)酵BC 膜［6］。王瑋瑜［7］研究用西瓜汁和蘋果汁生產出了性能良好的BC 膜，表明果汁等原料制備BC 有較好的技術可行性。木醋桿菌和紅茶菌是發(fā)酵BC 常用的菌種［8-10］，紅茶菌主要由酵母菌、醋酸菌和少數乳酸菌組成，可通過發(fā)酵產生葡萄糖醛酸、纖維素等成分［11-13］；而pH是影響B(tài)C 產率的重要因素之一，pH 為6.0～7.0可有效提高BC 產率［13］。關于BC 膜的應用方面，改良后的BC 膜具備抗菌、防紫外線功能等新的性能特征，可應用于生物醫(yī)療輔料促進傷口愈合或可降解包裝材料等方向［2,14］?！颈狙芯壳腥朦c】前人對BC 培養(yǎng)方式的研究表明，不同培養(yǎng)條件下BC 產率存在差異，如西瓜汁生產BC 的產率是蘋果汁的1.9 倍［7］，經紫外誘變及篩選后的木醋桿菌生產BC 的產率提升了4.8 倍［8］，酶解后柑橘渣生產BC 的產率提高了2.2 倍［6］。由此可見，不同的原材料、菌種及培養(yǎng)方式均會對BC的產率以及性質產生明顯的影響?！緮M解決的關鍵問題】本研究以新會柑肉果汁為主要原料制備BC 膜，通過單因素分析及膜性能表征，探究新會柑果汁作為生產BC 原料的可行性，可為新會柑肉的開發(fā)利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：紅茶菌，購于紅茶菌酵素有限公司。

種子培養(yǎng)基(g/L)：紅茶葉10 g，蔗糖100 g，蒸餾水1 000 mL，煮沸5 min 后將茶葉撈出，于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃條件下滅菌15～20 min，滅菌后冷卻置4 ℃下冷藏保存。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鈉8 g，磷酸二氫鉀5 g，硫酸鎂2 g，檸檬酸2.0 g，以新會柑果汁補足至1 000 mL。用0.1 mol/L NaOH 調節(jié)pH 至6.8～7.0，置于高壓蒸汽滅菌鍋 121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后在4 ℃下冷藏保存［15］。

主要儀器：恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；BPG-9106A 精密鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；珠江牌培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；手提式折光儀，東莞三量量具有限公司；PHS-3C-02 型實驗室pH 計，上海三信儀表廠；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵，鞏義市子華儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；梅特勒-托利多系列電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；日立S-4800 掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津實驗器材有限公司；X 射線衍射儀，德國國布魯克公司。

1.2 試驗方法

1.2.1柑肉預處理 將新會柑剝皮、去核分離出來的柑肉榨汁后，經0.425 mm 篩網分離出多余的果渣。分別在柑汁中添加0.1%（W/V）的果膠酶、纖維素酶、纖維素+果膠酶［15］，室溫下攪拌均勻且酶解12 h 后，置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃下滅菌20 min，分別得到純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液（即培養(yǎng)原液），于4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌種活化與靜態(tài)培養(yǎng) 接入10 mL 紅茶菌菌液至種子培養(yǎng)基，并置于恒溫振蕩器中，28 ℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)48 h 完成活化，將菌種保存于4 ℃的冰箱中備用。按培養(yǎng)基 10% (V/V) 的接種量接入活化菌種后，使用封口膜封口處理，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下靜置培養(yǎng)11 d［7］。

1.2.3單因素試驗 在1.1發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，分別改變檸檬酸添加量、發(fā)酵時間、pH 及培養(yǎng)原液，探究其對BC 膜產率的影響［8,15］：（1）pH分別設置為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他營養(yǎng)成分不變；（2）檸檬酸添加量分別設置為0、2、4、6、8 g/L，其他營養(yǎng)成分不變，調整pH 為 6.8～7.0；（3）發(fā)酵時間分別設置為9、11、13、15、17 d，培養(yǎng)原液營養(yǎng)成分不變，調整pH 為6.8～7.0；（4）培養(yǎng)原液分別設置為純柑汁、纖維素酶解液、果膠酶解液、纖維素+果膠酶解液，其他營養(yǎng)成分不變，調整pH 為6.8～7.0。單因素試驗的培養(yǎng)條件依照1.2.2 的靜態(tài)培養(yǎng)法，培養(yǎng)出的細菌纖維素膜按照1.2.4 的步驟進行純化，按1.3.2 的干膜產率計算方法評價細菌纖維素產率，確定紅茶菌最佳發(fā)酵條件。

1.2.4纖維素膜的純化 將靜態(tài)培養(yǎng)的BC 膜用流水沖洗10 min 后，置于0.1 mol/L NaOH 溶液中煮沸 30 min，至呈現白色半透明狀態(tài)，然后用蒸餾水沖洗至濕膜表面pH 為 7.0 左右［7］。

1.3 測定項目及方法

1.3.1糖度、pH 測定及BC 膜評價 分別用手提式折光儀和pH 計測定柑汁及酶解液的糖度和pH值。采用干膜產率、含水率和復水率評價BC 膜。用濾紙拭去膜表面水分并稱重，得到濕膜質量；再將其置于烘箱中50 ℃下干燥12 h，稱量，得到干膜質量［7］。稱量BC 膜的濕膜、干膜質量后，計算BC 產率及含水率［16］。干膜稱重后，于培養(yǎng)皿中用蒸餾水浸泡24 h，用濾紙拭去其表面水分，稱重，計算BC 膜的復水率。

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1.3.2紅外光譜（FTIR）和掃描電鏡（SEM）觀察 測試前將4 種培養(yǎng)原液生產出的BC 膜分別置于50 ℃烘箱內烘干30 min，冷卻至室溫后加入適量KBr 粉末研磨，混合均勻后壓片，以分辨率4、掃描范圍400～4 000 cm-1條件下進行紅外光譜掃描，并進行數據庫檢索比對［17］。

分別剪取邊長為1～1.2 cm 的四方形BC 膜貼于導電膠上，置于真空鍍膜機內進行表面噴金1 min，于掃描電鏡中，在觀察電壓為5 kV 條件下進行觀察［10,17］。

1.3.3X 射線衍射（XRD）BC 膜于50 ℃烘干后，冷卻并研磨至粉末狀，取適量粉末置于X 射線衍射儀，在 40 kV 高壓、Cu 靶、管流設置為 40 mA、衍射角度2θ 為5°～50°檢測條件下進行XRD掃描，并用jade 軟件檢索標準物質［17-18］，計算結晶度（CI）：

式中，Iam為非結晶區(qū)衍射角度2θ 為18°時的強度值，I020為衍射最高強度值。

2 結果與分析

2.1 柑汁不同預處理前后基本特征的變化

未經酶解處理的新榨柑汁含有較多果膠和纖維，柑汁經3 次過濾后仍渾濁粘稠；而經酶解預處理后的柑汁澄清，底部出現黃色絮狀沉淀。由圖1 可知，純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液的糖度分別為10.9%、7.1%、6.9%、8.2%，酶解后的糖度均低于未酶解處理的糖度，其原因可能是未經滅菌處理的柑汁本身存在有酵母菌等嗜糖性的微生物，酶解時間過長導致微生物生長消耗一部分糖分使得糖度降低；酶解液的pH 與純柑汁沒有明顯差異，均為偏酸性。

圖1 不同培養(yǎng)原液的pH 及糖度對比Fig.1 Comparison of pH and Brix of different culture solution

2.2 BC 產率的單因素分析

由圖2A 可知，柑汁未添加檸檬酸時BC 產率最大，在檸檬酸添加量達到4 g/L 時無BC 產生。在發(fā)酵培養(yǎng)基配方設計中添加檸檬酸的原因是檸檬酸參與紅茶菌的三羧酸循環(huán)，進行物質轉換和能量代謝，可有效提升紅茶菌的新陳代謝能水平，從而提高BC 產率［15,19］；但檸檬酸過高，三羧酸循環(huán)的反饋機制增強，可能導致產率下降，由于新會柑含有大量以檸檬酸為主的有機酸，對于柑汁培養(yǎng)基而言，額外添加檸檬酸對BC 膜產率起抑制作用。為避免添加檸檬酸導致pH 再變化，本研究在添加檸檬酸之后統(tǒng)一調整pH 至6.8～7.0，以消除檸檬酸對pH 的影響。

由圖2B 可知，pH 對BC 膜的產率具有明顯影響，當pH 為6.0 時BC 膜產率最高，pH 在5.0～7.0之間的變化相對較小，偏離此范圍后產率快速下降。紅茶菌適合在弱酸性的培養(yǎng)環(huán)境中生長，發(fā)酵液最佳的初始pH 在6.0 附近［13］。對柑汁預先進行酶解處理，在產率上沒有明顯優(yōu)勢，反而略低于純柑汁作為培養(yǎng)原液的產率。

由圖2C 可知，在一定時間范圍內BC 產率與培養(yǎng)時間呈正相關，在15 d 到達峰值后呈下降趨勢。原因可能是紅茶菌生產的BC 膜也是其代謝所需要的碳源，當培養(yǎng)液中的碳源耗盡時，紅茶菌對BC 膜消耗速率高于分泌速率［20］。由圖2D可知，酶解預處理對產率無明顯促進作用，不同預處理培養(yǎng)原液的BC 產率依次為純柑汁＞果膠酶+纖維素酶解液＞纖維素酶解液＞果膠酶解液。

圖2 不同因素對BC 產率的影響Fig.2 Effects of different factors on BC yield

2.3 BC 膜的結構表征

2.3.1含水率及復水率 如圖3 所示，不同培養(yǎng)原液生產的BC 膜均呈黃褐色半色透明的水凝膠狀，經純化后呈白色透明凝膠狀，烘干后干膜呈紙片狀。由圖4 可知，4 種培養(yǎng)原液制備的BC 膜含水率均在98%以上，復水率均高于75%，具有重要基團頻率分析對比，在1 127 cm-1附近出現的吸收峰代表C-O 鍵的伸縮振動，2 875 cm-1附近的吸收峰代表C-H 鍵的伸縮振動，3 350 cm-1附近區(qū)域的吸收峰則反映O-H 基的伸縮振動，表明BC 膜主要存在O-H 基、C-H 鍵和C-O 鍵［17］。樣品圖譜經本地數據庫進行檢索對比，結果表明該物質為纖維素。良好的持水性能和復水性能，有利于活性物質吸附的變性處理［21-22］。

圖3 BC 膜處理前后的直觀變化Fig.3 Intuitive change diagram of BC membrane before and after treatments

圖4 不同培養(yǎng)原液的BC 膜含水率及復水率對比Fig.4 Comparison of water content and rehydration rate of BC membrane with different culture solutions

2.3.2紅外光譜表征分析 由圖5 可知，不同培養(yǎng)原液的紅外光譜均存在3 處明顯的吸收峰，經

圖5 細菌纖維素的紅外光譜Fig.5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

2.3.3X 射線衍射分析 以強度為縱軸、衍射角為橫軸，將不同培養(yǎng)原液培產出的BC 膜進行XRD 掃描，由X 射線衍射譜圖（圖6）可知，3個衍射角度14.1°、16.5°、22.9°分別代表纖維素結構的（01）、（11）和（002）3 個晶面的衍射峰［17-18］，經Jade 軟件檢索分析得出該樣品為纖維素，化學式為（C6H10O5）n；不同培養(yǎng)原液產出的BC 膜的結晶度均在80%以上。BC 膜的結晶度越高，其纖維的伸拉強度、密度也會相應增大，同時因結構致密，外部的水分子不易進入纖維內部，吸水性、柔軟性及化學活性會相應降低。

圖6 細菌纖維素的XRD 譜圖和結晶度對比Fig.6 XRD pattern and crystallinity comparison of bacterial cellulose

2.3.4BC 膜的微觀結構 由圖7 可知，4 種不同培養(yǎng)原液產出的BC 膜均有三維網狀結構，但其纖維的結晶形態(tài)表現出較大的差異，其中純柑汁產出的BC 膜纖維較為纖細、具有多孔隙特征（圖7A），果膠酶解液產出的BC 膜纖維呈棱柱狀（圖7B），而纖維素酶解液、纖維素+果膠酶解液產出的BC 膜則分別呈現出球形和方形結構（圖7C、D）；所有BC 膜的纖維直徑均在80～400 nm之間，與王珊珊等［19］試驗所得的BC 膜相比，纖維直徑基本一致，但本研究中BC膜表面存在球形、方形纖維團和棱柱狀纖維束的形態(tài)，不同微觀結構的生成機制仍有待探究。

圖7 不同培養(yǎng)原液產出的BC 膜的SEM 圖Fig.7 SEM images of BC membranes produced by different culture solutions

3 討論

新會柑果汁中除含糖分和有機酸外還存在纖維和果膠類物質［23］，本研究結果表明，經果膠酶和纖維素酶酶解處理后的柑汁糖度下降而pH基本不變。研究表明，用纖維素和果膠酶處理柑橘果渣后，BC 產率有明顯提高［15］，而本研究酶解處理新會柑果汁后，BC 產率反而下降。結合相關研究［15,17］分析，其產率下降的原因可能是酶解時間過長導致糖分消耗下降，嗜糖的紅茶菌因后期可利用的糖分減少而導致BC 膜產率下降。紅茶菌為復合菌種，多次傳代后BC 的產率不穩(wěn)定。因此從紅茶菌中篩選出適應酸性果汁環(huán)境的高產菌種，并建立相應的發(fā)酵模型是未來新會柑果汁生產BC 的探索途徑之一［10］。

單因素試驗結果顯示，以純柑汁為原料，在不添加檸檬酸且發(fā)酵時間為15 d、pH 為6.0 的條件下可有效提高BC 膜的產率。與前人生產條件［13,15,19］相比，本研究不同點是無需添加檸檬酸且發(fā)酵時間偏長。推測原因可能是過多的檸檬酸導致紅茶菌三羧酸循環(huán)的負反饋機制增強［19］，從而使得產率下降；不同的培養(yǎng)原料和菌種會導致達到BC 最大產率所需的時間不同。以新會柑果汁為原料生產BC 需添加堿性物質調節(jié)培養(yǎng)液的pH，但其成本將提高，因此尋求廉價的堿性調節(jié)劑或適應酸環(huán)境的優(yōu)勢菌種是新的研究方向。

不同碳源產出的BC 膜可能具有不同的微觀結構，從而影響B(tài)C 膜的物理性能［22］。有研究表明，以秸稈水解液生產的BC 膜在SEM 圖下呈現超細纖維的三維網狀結構［24］。本研究以不同培養(yǎng)原液產出的BC 膜在SEM 圖則呈現出不同的纖維排列形態(tài)和結晶狀態(tài)，具體表現在SEM 圖出現了類似方形、球形、棱柱狀的纖維素，但其作用機制尚未明確。結合復水性能、紅外光譜和X 射線衍射得出，各培養(yǎng)原液培養(yǎng)出的產物均為結晶度在80%以上的BC 膜，不僅復水能力強且具有良好的張拉力學性能，與前人研究基本一致［17］。

4 結論

新會柑果汁的糖度為10.9%、pH 為3.9，酶解前后pH 保持一致但糖度均有所下降。單因素試驗表明，以純柑汁為原料，在不添加檸檬酸且發(fā)酵時間15 d、pH 為6.0 的條件下得到的BC 產率相對最高。采用純柑汁、果膠酶解液、纖維素酶解液、纖維素酶+果膠酶解液生產BC 膜，通過復水性能測試、X 射線衍射和SEM 分析得出，4 種類型BC 膜的復水率均高于75%、結晶度均高于80%，但其微觀結構存在較大差異，主要表現為BC 表面纖維的形態(tài)和結晶狀態(tài)的不同。本研究結果可為新會柑果汁生產BC提供技術支持，既能降低BC 的生產成本，同時也為新會柑的資源化開發(fā)提供思路。