苗會娟，徐艷梅，王春霞，蓋 成，高燕霞

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質量控制與評價重點實驗室，河北 石家莊 050200）

復方魚肝油氧化鋅軟膏又名復方氧化鋅魚肝油軟膏，為皮膚科非處方藥。其是由魚肝油、呋喃西林、氧化鋅、石蠟等制成的復方脂溶性軟膏，主要用于治療急慢性皮炎、凍瘡、輕度燒傷等［1-4］。呋喃西林屬防腐消毒藥，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌等有較好抗菌作用［5］。復方魚肝油氧化鋅軟膏現(xiàn)行質量標準收載于《國家藥品標準·化學藥品地方標準上升國家標準（第六冊）》［WS1-43（B）-89］，其中缺少呋喃西林含量控制項，給藥品質量控制、市場監(jiān)管、醫(yī)院和患者用藥產(chǎn)生了不可預知的影響。為保證用藥安全，本研究中建立了測定呋喃西林含量的高效液相色譜（HPLC）法，并按人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會（ICH）標準［6］進行驗證，旨在為復方魚肝油氧化鋅軟膏的質量控制和監(jiān)督提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000型高效液相色譜儀，包括DAD檢測器（美國Thermo Fisher公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；PB-20型pH計（德國Sartorius公司，精度為0.01 pH）；Memmert D91126型恒溫水浴振蕩器（德國Memert公司，準確度為0.1℃）。

1.2 試藥

復方魚肝油氧化鋅軟膏（天津市金耀藥業(yè)有限公司，批號分別為19030401，19030402，19030403，規(guī)格為每1 g中含呋喃西林1 mg）；呋喃西林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為101167-201001，含量99.4%）。三乙胺、乙腈均為色譜純，冰醋酸為優(yōu)級純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），檢測波長：375 nm，柱溫：30℃；進樣量：20 μL［7］。

2.2 溶液制備

取呋喃西林對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺1 mL使溶解并定容，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得呋喃西林質量濃度約為10 μg/mL的對照品溶液。取樣品約1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加水適量，置80℃水浴中劇烈振搖15 min使溶解，冷卻至室溫，全部轉移至100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按復方魚肝油氧化鋅軟膏處方工藝制備缺呋喃西林的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗及專屬性考察：精密吸取2.2項下3種溶液各20 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰，詳見圖1?？梢姡幮詫φ諢o干擾，理論板數(shù)按呋喃西林峰計均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖1.NitrofurazoneA．Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取呋喃西林對照品約10.60 mg，精密稱定，按2.2項下方法制備質量濃度為106.00 μg/mL的對照品貯備液，用水逐級稀釋，得呋喃西林質量濃度分別為0.50，1.06，4.24，10.60，50.30，106.00 μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.837 5X-0.756 5（r=0.998 7，n=6）。結果表明，呋喃西林質量濃度在0.50～106.00 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限及檢測限考察：往陰性樣品中添加對照品溶液，作為檢測供試品，按2.2項下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，計算信噪比（S/N），分別以S/N為3和10時的質量濃度作為檢測限及定量限。結果檢測限為0.1 μg/mL，定量限為0.3 μg/mL。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液（批號為19030403）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，22，24 h后，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.21%（n=7），表明室溫下供試品溶液放置24 h內基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為19030403）適量，按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，再按2.1項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積并計算含量。結果平均含量的RSD為0.96%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量樣品（批號為19030403，呋喃西林含量為0.90 mg/g）6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入呋喃西林對照品溶液（106.0 μg/mL）8 mL混勻，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為19030401，19030402，19030403）內容物，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3批樣品中呋喃西林含量分別為86.34，89.62，84.67 mg/g，平均86.88 mg/g。

3 討論

預試驗中，對對照品溶液和供試品溶液進行了全波長掃描，結果最大波長為375 nm，峰純度大于99%。取供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，考察不同色譜柱［Agilent ZORABAX C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Welch Xltimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，以不同液相色譜儀（日本Shimadzu LC-20A型、美國Agilent 1260型及美國Thermo Fisher U3000型）測定，結果均能滿足系統(tǒng)適用性要求。流動相先后考察了乙腈-30 mmoL/L磷酸氫二鈉溶液（含0.1%三乙胺，50%磷酸調pH為3.0）（18∶82，V/V）［8］，甲醇-水（60∶40，V/V）［9］、甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鈉（pH 7.0，30∶70，V/V）［10］、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫銨（pH 4.5，20∶80，V/V）［11］及0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V），發(fā)現(xiàn)加入三乙胺可減少呋喃西林色譜峰的拖尾，改善峰形，且該pH為4.0的條件下，與相鄰峰的分離度最好，且不含無機鹽，配制簡單，因此，選定0.2%三乙胺溶液（冰醋酸調pH至4.0）-乙腈（80∶20，V/V）作為流動相。

復方魚肝油氧化鋅軟膏為多組分化學藥，基質為無水羊毛脂和凡士林，為脂溶性基質，因此呋喃西林的提取要綜合考慮基質和其本身溶解性。呋喃西林在乙醇中微溶，在水中極微溶解，而無水羊毛脂和凡士林難溶于水和乙醇。根據(jù)這一差異，考察了乙醇、水作為提取的效果，結果顯示，兩者的測定結果和回收率基本一致。綜合考慮環(huán)保和經(jīng)濟性等因素，選用水作為提取溶劑，同時依據(jù)正交試驗原理［12-15］，考察了水浴溫度、提取時間和錐形瓶體積等因素對提取結果的影響，結果顯示，置100 mL錐形瓶中，80℃水浴加熱15 min的條件最佳。綜上所述，本研究中建立的方法分離效果和重復性均良好，測定結果準確，回收率高，可用于復方魚肝油氧化鋅軟膏中呋喃西林的含量測定。