朱嘉敏 謝小玉 梁 群

（黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

膿毒癥相關性腦病（SAE）是膿毒癥嚴重的并發(fā)癥之一，是全身炎癥反應間接引起的非中樞系統感染的彌漫性的腦功能障礙狀態(tài)，早期可出現神經系統損害及運動功能異常，如煩躁、譫妄等，逐漸發(fā)展為嗜睡、昏迷甚至死亡，存活患者部分會出現認知障礙、創(chuàng)傷刺激的心理后遺癥等［1］。國內研究顯示SAE死亡率超過25%，存活的患者中約15%出現認知功能障礙［2］。目前認為SAE的重要發(fā)病機制為膿毒血癥所致炎癥風暴通過神經通路及血腦屏障體液途徑導致的腦彌漫性神經炎，以及腦灌注障礙過程［3］。但其生理病理機制仍并未明確，西醫(yī)臨床治療一般為控制膿毒血癥及原發(fā)疾病，以臟器功能支持為主。研究表明右美托咪啶和褪黑素可以減少神志不清的發(fā)生頻率，但它們對SAE的療效仍有待證實［4］，因此中西醫(yī)結合治療成為治療SAE的新思路。根據SAE的臨床表現，屬于中醫(yī)“神昏”的范疇。醒腦靜注射液是以中醫(yī)治療急重癥的“溫病三寶”之一的安宮牛黃丸為底方而制成的現代中藥制劑，具有清熱解毒活血、開竅醒神的作用，臨床常用于多種腦部疾?。?-6］。故本研究利用網絡藥理學方法，對醒腦靜注射液中藥物的有效成分和醒腦靜注射液通過血腦屏障治療膿毒癥性腦病的分子作用靶點、細胞信號通路等方面進行探索，從而揭示其分子作用機制，為后續(xù)相關的研究奠定理論依據。

1 資料與方法

1.1 醒腦靜注射液活性成分篩選和靶點的獲取 醒腦靜注射液組成為郁金、梔子、冰片、麝香，本研究運用TCMSP數據庫（http：//lsp.Nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集醒腦靜注射液中4味中藥的化學成分，麝香為動物藥，在TCMSP未收錄，故通過BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）及文獻挖掘尋找其化學成分。根據TCMSP數據庫中藥物動力學（ADME）參數，將血腦屏障滲透率（BBB）≥-0.3和類藥性指數（DL）≥0.18作為閾值篩選活性化合物［7］，通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫尋找在 TCMSP數據庫未查找到靶點的化學成分的SMILES號，在SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）通過SwissADME篩選并尋找對應化學成分的作用靶點。接著將獲取的化合物潛在靶點上傳至UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點注釋，限定物種為人，獲得蛋白靶點對應的基因數據。

1.2 SAE疾病靶點篩選 以“Sepsis-associatedEncephalopathy”為關鍵詞，通過DisGeNET數據庫（https：//www.Disgenet.org/）、TTD數據庫（TherapeuticTargetDatabase，http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM數據庫（Online-MendelianInheritanceinMan，https：//www.omim.org/）、Durgbank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）、Genecard數據庫（https：//www.genecards.org/）收集SAE疾病靶點。

1.3 醒腦靜注射液治療SAE作用靶點預測 將獲取的藥物靶點信息與疾病靶點信息導入Venny2.1軟件，繪制韋恩圖，取交集得到共同靶點，作為醒腦靜注射液作用于SAE的預測靶點。

1.4 構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”可視化網絡 從“1.1”獲得的醒腦靜注射液活性成分對應基因靶點數據中，篩選出與“1.3”獲得的藥物同疾病交集靶點對應的數據，并導入Cytoscape3.8.0構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”可視化網絡。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網絡構建與關鍵靶點篩選 將共有靶點數據導入String數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），構建PPI網絡，將生物種類設定為“Homo sapiens”，可信度設置為＞0.4。將tsv文件導入Cytoscape3.8.0軟件進行可視化處理，使用NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，將等級值（degree）排名前11的基因作為重要靶點。同時將共有靶點數據使用MCODE模塊進行基因簇的分析。

1.6 基因本體（GO）富集分析與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將藥物、疾病共有靶點上傳至Metascape（http：//metascape.org/），參數設置為Hspecies，進行GO富集分析，選擇生物過程、分子功能、細胞組分進行富集；同時進行KEGG通路富集分析，篩選差異生物過程及靶點通路。并通過bioinformatics（http：//www.bioinfor-matics.com.cn/）對GO功能和KEGG信號通路富集分析結果進行可視化處理。

1.7 分子對接驗證 在所得的PPI網絡中，選取等級值前11的關鍵基因靶點與其對應的化學成分實行分子對接驗證。通過PDB蛋白質數據庫（http：//www.pdb.org/）下載靶基因蛋白構象，使用AutoTools對蛋白進行去水分子加氫等預處理。并使用AutodockVina進行化合物分子配體與靶基因蛋白受體對接，用PyMOL繪制化合物分子與靶基因蛋白相互作用圖，并記錄每個對接的結合能。

2 結果

2.1 醒腦靜注射液成分篩選和靶點的獲取 共獲得中藥化合物46個，其中冰片4個，共147個作用靶點；郁金15個，共512個作用靶點；梔子17個，共522個作用靶點；麝香12個，共367個作用靶點。除去重復靶點，最終得543個藥物作用靶點，將篩選出的靶蛋白名通過Uniprot數據庫進行規(guī)范化注釋。

2.2 SAE疾病靶點篩選結果 在DisGeNET、TTD、OMIM、Durgbank、Genecard數據庫檢索SAE相關基因，數據匯總刪除重復靶點后，共獲得596個相關基因。

2.3 醒腦靜注射液治療SAE靶點預測結果 將篩選出的543個藥物靶點與596個疾病靶點輸入Venny2.1軟件，交集得到42個共有靶點，作為藥物作用于疾病的預測靶點，見圖1。

圖1 醒腦靜注射液活性成分與SAE疾病靶點Venn圖

2.4 醒腦靜注射液-成分-靶點-疾病可視化網絡構建結果 將“1.4”獲得的數據整理及注釋后，導入cytoscape繪制醒腦靜注射液藥物-成分-靶點-疾病相互作用網絡圖（見圖2）。其中藍色圓形節(jié)點代表梔子（ZZ）、冰片（BP）、郁金（YJ）、麝香（SX），橘色圓形節(jié)點代表各自藥物對應的活性化合物，按度值設置大小。綠色節(jié)點A1為梔子、郁金共有成分，B1代表梔子、冰片共有成分。紫色圓形節(jié)點代表藥物作用靶點，連線代表化合物與靶點的相互作用。根據當中得到的各化合物中位度值（degree），排名前10的化學物質可能為醒腦靜治療SAE的重要活性成分，見表1。

表1 醒腦靜注射液關鍵化合物信息表

圖2 醒腦靜注射液藥物-成分-靶點-疾病相互作用網絡圖

2.5 PPI網絡構建和關鍵靶點篩選結果 見圖3。圖3為構建的PPI網絡圖，節(jié)點的大小和顏色根據等級值調整，節(jié)點越大，顏色越深，表示等級值越大。其中PPI數據中得到的degree值中位數為18，分值大于中位數值的基因共有20個，選取degree值排名前11的基因作為關鍵靶點，分別為：INF（31）、IL-6（31）、TLR4（29）、CASP3（28）、VEGFA（27）、STAT3（27）、SRC（26）、ICAM1（26）、MMP9（25）、HIF1A（24）、NOS3（24）。將共有基因靶點通過Metascape中MCODE模塊對PPI網絡進行基因簇分析，得到4個基因簇，見表2，說明醒腦靜注射液治療SAE與炎癥感染免疫、神經信號傳導、氧信號通路等有關，見圖4。

圖3 醒腦靜注射液治療SAE交集靶點網絡圖

表2 交集靶點聚類分析

圖4 交集靶點基因簇分類圖

2.6 GO功能富集和KEGG信號通路富集分析 共富集到791條生物過程相關條目，46條分子功能條目，62條細胞組分條目。根據P值大小（P＜0.01），對生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）的重要條目進行繪制（如圖5）。生物過程主要為細菌源性分子的反應、細胞因子產生的正向調節(jié)、細胞對有機氮化合物的反應、蛋白激酶B信號的調節(jié)、水解酶活性的正調節(jié)、血紅蛋白、DNA結合轉錄因子活性的正調節(jié)、對肽的反應、對流體剪應力的響應、小分子代謝過程的正規(guī)調節(jié)、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號傳導的正規(guī)調節(jié)、對化學脅迫的細胞反應、細胞群增殖的負調節(jié)、對機械刺激的反應等。細胞組分主要有受體復合物、膜筏、膜的側面、神經元細胞體、細胞質的核周區(qū)域、質膜信號受體復合物、細胞外基質、軸突等。分子功能主要涉及GABA門控氯離子通道活性、生長因子受體結合、蛋白質同源化活性、血紅素結合、支架蛋白結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶結合、蛋白酶結合、內肽酶活性、整合素結合、脂質結合、肽結合等。運用Metascape進行KEGG信號通路富集分析，共獲得103條信號通路。根據P值（P＜0.01）排序，對前16條KEGG信號通路富集分析結果進行氣泡圖繪制（見圖6），涉及脂質和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關性皰疹病毒感染、癌癥中的蛋白聚糖、尼古丁成癮、瘧疾、PI3K-蛋白激酶B（Akt）信號通路、HIF-1信號通路、松弛素信號通路、利什曼病、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、胰腺癌、Rap1信號通路、中性粒細胞細胞外陷阱形成、癌癥中的轉錄失調、cAMP、5-羥色胺能突觸信號通路。

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG信號通路富集分析

2.7 分子對接驗證結果 將排名前11的核心靶點的靶蛋白與其對應化合物的小分子蛋白配體進行分子對接，其對應的活性化合物大部分與醒腦靜通過血腦屏障治療SAE的位于前十的重要化合物相對應。分子對接結合能越小說明對接效果越好，結合能＜-7表示具有較好的結合活性［8］。結果見表3，分子對接顯示出較好的結合能力，表明SAE關鍵靶點與其對應的醒腦靜活性成分結合性較好。圖7（A）顯示MMP9與7，4'-二羥基黃酮結合情況，圖7（B）顯示NOS3與熊果酸結合情況。

表3 核心靶點與其對應化合物的分子對接信息表

圖7 靶基因與化合物結合接合情況

3 討論

SAE是膿毒癥常見的并發(fā)癥，是全身炎癥反應間接起的非中樞系統感染的彌漫性的腦功能障礙狀態(tài)［9］，西醫(yī)治療上早期有效的應用抗感染藥物、及時補充血容量，多器官功能的保護、對意識狀態(tài)改變的早期識別都能減緩SAE的發(fā)生發(fā)展，但無法根治，一些神經類藥物運用的有效性和風險仍缺乏大樣本試驗驗證［10］。醒腦靜注射液以出自清代醫(yī)家吳鞠通的《溫病條辨》之安宮牛黃丸為底方制成，含郁金、梔子、冰片、麝香4味藥。其中麝香、冰片退熱開竅醒神，郁金、梔子涼血活血、行氣解郁，4味藥配合共奏清熱解毒之力。研究表明使用醒腦靜注射液能明顯改善SAE患者的意識狀態(tài)，患者血中神經元特異性烯醇化酶（NSE）、白細胞介素-6（IL-6）及C反應蛋白（CRP）明顯減低［11］。

本研究通過網絡藥理分析發(fā)現，醒腦靜注射液通過血腦屏障治療SAE的化學成分主要有四氫脫甲氧基二阿魏酰甲烷（郁金）、7，4'-二羥基黃酮（梔子）、齊墩果酸（冰片、梔子）、3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮（麝香）等。四氫脫甲氧基二阿魏酰甲烷又稱雙脫甲氧基四氫姜黃素，為姜黃素類化合物，姜黃素類是郁金化學成分主要的種類之一。郁金為活血化瘀藥，其含的姜黃素可通過調節(jié)脂質代謝、抗凝與促凝的平衡來改善血液循環(huán)，可經PI3K-Akt信號通路對SAE發(fā)揮抗病毒作用，還可通過抗氧化酶活性對腦神經起保護作用［12］。梔子為清熱瀉火藥，7，4'-二羥基黃酮屬梔子主要的化學成分黃酮類。其能降低膽固醇水平，防止動脈粥樣硬化；通過抑制TNF-α、降低NO、增加Caspase-3的活性等，從而對SAE起免疫調節(jié)與抗炎作用；還可通過調節(jié)5-羥色胺受體對神經中樞起保護作用［13-14］。冰片、麝香同屬于開竅藥，冰片中含有的齊墩果酸、龍腦香醇等能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，并能通過抑制5-羥色胺、提高γ-氨基丁酸（GABA）含量，從而對SAE患者中樞神經起到即鎮(zhèn)靜安神又醒腦開竅的雙向調節(jié)作用［15］。3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮屬甾體類化合物，甾體類是麝香的主要成分。研究表明麝香可通過血腦屏障直接作用于中樞神經系統，也可擴張腦血管，改善腦循環(huán)，減輕組織缺血程度［16］。

交集基因可分為4大類基因簇，其中重要靶點為TNF、IL-6、TLR4、CASP3、VEGFA等。大腦彌漫性神經炎癥以及腦灌注障礙被認為是SAE病的重要病理機制［17］。臨床上膿毒癥多由內毒素如脂多糖（LPS）引起，LPS與其結合蛋白（LBP）結合，通過Toll樣受體2和4等相關信號通路傳導來啟動炎癥因子上調，合成促炎細胞因子如TNF、IL-6等，嚴重時可誘發(fā)SAE的發(fā)生。TLR4即Toll4受體，Li等［18］通過研究發(fā)現TLR4/NF-κB通路是SAE發(fā)生大腦彌漫性神經炎癥的主要機制通路，可誘使SAE大鼠神經元損傷、海馬區(qū)細胞凋亡。蒙振發(fā)等［19］研究表明TNF、IL-6是參與SAE大腦彌漫性神經炎癥重要的細胞因子，介導過度的中性粒細胞在腦組織浸潤激活，同時啟動腦內多種促炎因子的表達，通過對TNF、IL-6的監(jiān)測對SAE的早期診斷及用藥治療前后的有效性具有明顯的價值。CASP3主要參與細胞凋亡的信號傳導過程，蘇云潔等［20］通過大鼠實驗發(fā)現，SAE時大腦皮質神經元凋亡蛋白酶CASP3表達上調。TNF、IL-6、TLR4、CASP3的參與提示醒腦靜可通過抑制炎癥反應、調節(jié)免疫、細胞凋亡來抑制大腦彌漫性神經炎癥，從而治療SAE。VEGFA為血管內皮生長因子A，可增加血管通透性。研究發(fā)現當SAE時，星形膠質細胞釋放VEGFA，導致腦內皮細胞緊密連接蛋白的表達下調，血腦屏障破壞，微循環(huán)損傷從而造成腦灌注障礙［21］。這提示醒腦靜可通過改善腦組織血液循環(huán)來起到治療SAE的效果。

通過富集分析可得出醒腦靜透過血腦屏障治療SAE的作用機制除與炎癥感染、免疫調節(jié)、神經遞質傳遞等信號通路有關，還與脂質代謝、細胞凋亡、缺氧通路有關。趙春剛等［22］發(fā)現伴高同型半胱氨酸血癥的膿毒癥患者可出現脂質代謝、氧化應激異常等情況，導致內皮細胞功能障礙，致使神經細胞凋亡，進而增加SAE發(fā)生的風險。邱名耀等［23］通過大鼠實驗研究發(fā)現磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路的活化可抑制下游促凋亡因子釋放，降低氧化應激，改善SAE腦損傷。HIF-1信號通路可受缺氧細胞激活，對糖酵解有重要調節(jié)作用。張麗娜［24］通過實驗研究認為，SAE是由于大腦炎癥風暴及腦灌注障礙所造成的腦細胞缺血缺氧。腦紅蛋白（Ngb）表達上調是缺氧誘發(fā)機體啟動神經系統自我保護的重要組成部分。Ngb通過HIF-1信號通路減少自由基ROS的產生為Ngb腦保護的重要途徑。因此從干預Ngb-HIF-1-ROS信號通路的角度來研究治療SAE的意義是非常大的。

綜上所述，醒腦靜通過多靶點、多通路實現對疾病SAE的調控，其調節(jié)的信號通路與SAE的病理機制有密切聯系，醒腦靜通過抑制SAE患者腦組織彌漫性神經炎癥、保護血腦屏障，改善腦血流灌注、調節(jié)神經遞質等來發(fā)揮其清熱解毒、活血化瘀、醒腦開竅的功效。對醒腦靜作用靶點的認識，可擴大其治療用途，實現“異病同治”，同時也可針對SAE疾病的基因靶點，尋找更加匹配的治療藥物，實現“同病異治”。